TIRFM og pH-følsomme GFP-prober til Evaluer Neurotransmitter Vesikel Dynamics i SH-SY5Y neuroblastomaceller: Cell Imaging og Data Analysis

Kemisk synaptisk transmission mellem neuroner er en vigtig mekanisme for kommunikation i nervesystemet. Den er afhængig af frigivelse af neurotransmittere gennem en dynamisk cyklus af vesikelfusion og hentning på den præsynaptiske sted. Mange af de involverede i vesikel dynamik proteiner er blevet identificeret; men deres bidrag til fænomenet uafklaret ^1.

Vores forståelse er delvist begrænset af, at de mest anvendte assays for exo / endocytose er ikke altid den mest hensigtsmæssige. Adskillige undersøgelser vedrørende vesikelfusion og dynamik afhængige elektrofysiologiske teknikker. Denne teknik giver en optimal tidsmæssig opløsning og er fremragende til at undersøge den indledende fusion af vesikler til plasmamembranen, men er ude af stand til at detektere mange af de underliggende molekylære begivenheder, der understøtter præsynaptiske funktion. Elektronmikroskopi, på den anden side tilvejebringer den fineste morphological beskrivelse af hver ental skridt, men det dynamiske aspekt af begivenheden kan ikke lagres, fordi prøverne skal fastsættes for at blive analyseret.

Fremkomsten af nye optiske optagelse teknikker ^2,3, kombineret med fremskridt inden for fluorescerende molekylære prober udvikling ^4-6, muliggør visualisering af eksocytiske processer i levende celler, hvilket giver nye niveauer af information om den synaptiske struktur og funktion.

Indledende undersøgelser udnyttede aktivitet-afhængige styrylfarvestoffer (FM1-43 og beslægtede organiske farvestoffer) ^7,8. State-of-the-art billeddiagnostiske teknikker ansætte pH-følsomme varianter af grønt fluorescerende protein (GFP) (pHluorin) tøjret til luminale blærer proteiner ^9. Disse prober normalt slukket, når til stede i vesiklerne på grund af den lave luminale pH. Efter fusion med plasmamembranen, er vesiklen indre udsat for neutral ekstracellulære rum, pH brat stiger, lindrer proton-afhængige quenching af pHluorin og det fluorescerende signal hurtigt frem. Som ændringen i pHluorin er hurtigere end fusion begivenhed, ved at overvåge fluorescens stiger, kan måles og analyseres vesikelfusion med membranen. Fordi overfladen pHluorin-mærkede molekyler endocytoseres, fluorescenssignalet efterfølgende vender tilbage til basisniveauet, derfor den samme konstruktion kan også anvendes til at overvåge vesikel genanvendelse ^9.

Mens vesikel-mærkede pH-sensor sikrer visualisering kun af disse blærer, der virkelig fusionere med plasmamembranen, er billedbehandling ved høj rumlig og tidsmæssig opløsning kræves for at beskrive i detaljer de trin, der er involveret i exo / endocytiske processer. Den optiske teknik, der giver den nødvendige spatio-temporale opløsning er total intern refleksion fluorescensmikroskopi (TIRFM), en anvendelse af fluorescensmikroskopi ^10.

"> Samlet indre refleksion opstår ved grænsefladen mellem glasset cover-slip og prøven. Når lysbanen når glasdæksel-slip med en hændelse vinkel større end den kritiske vinkel, er excitationslyset ikke overføres til prøven, men er fuldstændigt reflekteret tilbage. Under disse betingelser en flygtige lys bølgeformer ved grænsefladen og udbreder i mediet med mindre optisk tæthed (prøven). Da intensiteten af ​​det flygtige felt henfalder eksponentielt med afstanden fra grænsefladen (med en indtrængningsdybde ca. 100 nm) kun fluoroforer i nærmeste nærhed til cover-slip kan exciteres mens dem længere væk fra grænsen er ikke. I celler transficeret med GFP-konstruktioner, denne dybde svarer til proteiner udtrykt på plasmamembranen eller i vesikulære strukturer nærmer det. Som fluoroforer i cellens indre ikke kan exciteres, er baggrundsfluorescens minimeres, og et billede med et meget højt signal / baggrund rotteio dannes ^11.

Flere egenskaber gør TIRFM teknikken med valg til overvågning vesikler dynamik. Den perfekte kontrast og høj signal-til-støj-forholdet muliggør påvisning af meget lave signaler stammer fra enkelte vesikler. Chip-baserede billedoptagelse i hver ramme giver den tidsmæssige opløsning er nødvendige for at detektere meget dynamiske processer. Endelig er minimal eksponering af celler for lys på noget andet plan i prøven kraftigt reducerer fototoksicitet og muliggør langvarig tidsforskudt optagelse ^12.

Dataanalyse fortsat det mest udfordrende og afgørende aspekt af denne teknik. Den enkleste måde at overvåge vesikelfusion er at måle akkumulering af reporter fluorescerende proteiner på celleoverfladen, over tid ^13. Som fusionsproteiner stiger, netto fluorescenssignal stiger såvel. Imidlertid kan denne metode undervurdere processen, især i store celler og i hviletilstande,fordi endocytose og fotoblegning processer opveje stigningen i fluorescensintensitet grund vesikel exocytose. En alternativ metode er at følge hver begivenhed enkelt fusion ^14. Denne sidstnævnte fremgangsmåde er meget følsom og kan afsløre vigtige oplysninger om mekanismerne fusion. Men det kræver manuel udvælgelse af enkelte begivenheder, fordi helt automatiske procedurer til at følge vesikler og registrere udsving i deres fluorescerende signaler er ikke altid tilgængelige. Observation af vesikel dynamik kræver prøveudtagning celler ved høj frekvens. Dette genererer en stor mængde data, der næppe kan analyseres manuelt.

Forslaget med dette oplæg er at optimere TIRFM imaging teknik til overvågning af basal og stimuleret neurotransmitterfrigivelse i SH-5YSY neuroblastomcellelinje, og beskrive, trin-for-trin, en procedure udviklet i laboratoriet for at analysere data, både ved hel-celle og enkelt vesikel niveauer.