神经元之间的化学突触传递是通信中的神经系统的主要机制。它依赖于神经递质通过囊泡融合和检索的动态循环的释放在突触前部位。许多参与囊泡动力学的蛋白质已被鉴定;然而，它们对这一现象的具体贡献仍有待阐明^1。

我们的理解是由以下事实最广泛使用的测定法外/胞吞作用并不总是最合适的部分的限制。相关囊泡融合一些研究和动态依靠电生理技术。这种技术提供了一个最佳的时间分辨率和优良调查囊泡至质膜的初始熔化，但无法检测到许多支持突触功能的基本分子事件。电子显微镜，在另一侧，提供了最好的morphologica每个奇异步骤，但是事件的动态方面的升说明不能被捕获，因为样品必须固定以便进行分析。

的新的光记录技术^2,3，结合在荧光分子探针发展^4-6进步的出现，使得在活细胞中胞吐过程的可视化，从而提供约突触的结构和功能的信息的新的水平。

最初的研究开发活动相关的苯乙烯染料（FM1 – 43和相关有机染料^）7,8。国家的最先进的成像技术采用了绿色荧光蛋白（GFP）（pHluorin）拴管腔小泡蛋白⁹的pH敏感的变体。这些探针通常被关闭，因为低pH值管腔的囊泡当存在时。融合与质膜后，囊泡内部暴露于中性细胞外空间中，pH突然增加，缓解pHluorin的质子依赖淬火和荧光信号迅速出现。如pHluorin的变化的速度比的融合事件，通过监测荧光的增加，囊泡融合与膜可以测量和分析。因为表面pHluorin标签的分子被内吞，所述荧光信号随后返回到基础水平，因此也可以使用相同的构建体并监控囊泡再循环^9。

而囊泡标记的pH传感器可以确保只有那些囊泡真正融合与质膜的可视化，成像在高空间和时间分辨率是必需的，以详细描述了所涉及的外/内吞过程的步骤。的光学技术，它提供了必要的时空分辨率为全内反射荧光显微镜（TIRFM），荧光显微镜¹⁰的应用程序。

有几个特点使选择的TIRFM技术监测囊泡动态。完美的对比度和高的信号 – 噪声比允许非常低的信号从单个囊泡导出的检测。在各帧的基于芯片的图像采集提供必要检测高动态过程的时间分辨率。最后，细胞的最小曝光的样品中任何其他飞机大大地减少光毒性，并能持久延时录制^12。

数据分析仍然这种技术的最具挑战性的和关键的方面。监视囊泡融合的最简单的方法是测量报告荧光蛋白在细胞表面的积累，随着时间的推移^13。作为融合的增加，净荧光信号也增加。然而，这种方法可能会低估的过程中，特别是在大的细胞和在静止的条件下，因为内吞作用和漂白过程偏移由于囊泡的胞吐作用的增加的荧光强度。另一种方法是按照每个单个融合事件^14。这后一种方法是很敏感的，并且可以揭示关于融合的机制的重要细节。然而，它要求手动选择单一活动，因为完全自动化程序遵循囊泡和登记他们的荧光信号的波动并不总是可用。囊泡动力学的观察要求采样单元在高频率。这会产生大量的数据，可以几乎不进行手动分析。

本文的建议是优化TIRFM成像技术用于监测基底和刺激的神经递质释放，在SH-5YSY神经母细胞瘤细胞系，并描述，一步一步，在实验室中开发的程序来分析数据，既在全细胞和单囊泡水平。