انتقال متشابك الكيميائية بين الخلايا العصبية هو آلية رئيسية للاتصال في الجهاز العصبي. وهي تعتمد على إطلاق النواقل العصبية من خلال دورة ديناميكية من الانصهار الحويصلة واسترجاعها في الموقع قبل المشبكي. وقد تم تحديد العديد من البروتينات المشاركة في ديناميات الحويصلة. ومع ذلك، لا تزال المساهمة المحددة لهذه الظاهرة إلى توضيح ^1.

فهمنا يقتصر جزئيا بحقيقة أن المقايسات الأكثر استخداما لإكسو / الإلتقام ليست دائما الأنسب. العديد من الدراسات المتعلقة الانصهار الحويصلة وديناميكية تعتمد على تقنيات الكهربية. توفر هذه التقنية على قرار الزمني الأمثل وممتازة للتحقيق الانصهار الأولي من الحويصلات إلى غشاء البلازما ولكن غير قادرة على الكشف عن العديد من الأحداث الجزيئية الكامنة التي تدعم وظيفة قبل المشبكي. الإلكترون المجهري، على الجانب الآخر، يوفر أرقى morphologicaل وصف لكل خطوة واحدة، ولكن الجانب الديناميكي لهذا الحدث لا يمكن القبض، لأن العينات يجب أن تكون ثابتة لكي يتم تحليلها.

ظهور تقنيات التسجيل البصري الجديدة ^2،3، في تركيبة مع التقدم في الفلورسنت تطوير تحقيقات الجزيئية ^4-6، وتمكن التصور من العمليات exocytic في الخلايا الحية، وبالتالي توفير مستويات جديدة من المعلومات حول بنية متشابك وظيفة.

الدراسات الأولية استغلال الأصباغ التي تعتمد على النشاط styryl (FM1-43 والأصباغ العضوية ذات الصلة) ^7،8. دولة من بين الفن وتقنيات التصوير توظف المتغيرات الحساسة الرقم الهيدروجيني للالبروتين الأخضر نيون (GFP) (pHluorin) المربوطة إلى الحويصلات اللمعية البروتينات ^9. يتم تبديل هذه التحقيقات عادة قبالة عندما تكون موجودة في الحويصلات بسبب انخفاض درجة الحموضة اللمعية. بعد الاندماج مع غشاء البلازما، يتعرض الداخلية الحويصلة إلى الفضاء خارج الخلية محايد، ودرجة الحموضة يزيد فجأة، ويخفف من وتبريد تعتمد على بروتون من pHluorin ويظهر إشارة الفلورسنت بسرعة. كما تغير في pHluorin أسرع من الحدث الانصهار، من خلال رصد زيادات مضان، الانصهار الحويصلة مع غشاء يمكن قياسها وتحليلها. لأن endocytosed سطح جزيئات الموسومة pHluorin، إشارة مضان يعود بعد ذلك إلى المستوى القاعدي، وبالتالي فإن نفس التركيبة يمكن أن تستخدم أيضا لمراقبة الحويصلة إعادة تدوير ^9.

في حين أن الموسومة حويصلة درجة الحموضة استشعار يضمن التصور فقط من تلك الحويصلات التي تلتحم حقا مع غشاء البلازما، مطلوب التصوير في القرار المكانية والزمانية عالية لوصف بالتفصيل الخطوات المتبعة في إكسو / العمليات التقامي. هذه التقنية البصرية التي توفر الدقة المكانية والزمانية الضروري هو مجموع المجهري التأمل الداخلي مضان (TIRFM)، وهو تطبيق مضان المجهري ^10.

"> يحدث الانعكاس الكلي الداخلي في واجهة بين الزجاج غطاء الانزلاق والعينة. عندما يصل مسار الضوء الزجاج غطاء للانزلاق مع زاوية الحادث أكبر من الزاوية الحرجة، لا ينتقل ضوء الإثارة في العينة ولكن تنعكس تماما الظهر. وفي ظل هذه الظروف، وهو زائل أشكال موجة الضوء في واجهة ويكاثر على المدى المتوسط ​​مع أقل كثافة ضوئية (العينة). وبما أن شدة المجال زائل يضمحل بشكل كبير، مع البعد عن واجهة (مع عمق تغلغل حوالي 100 نانومتر) فقط fluorophores في أقرب القرب من غطاء الانزلاق يمكن أن يكون سعيدا في حين أن أولئك بعيدا عن الحدود ليست كذلك. في الخلايا transfected مع GFP-يبني، هذا العمق يتوافق مع البروتينات وأعرب على غشاء البلازما أو في هياكل حويصلي الاقتراب منه. كما fluorophores في داخل الخلية لا يمكن متحمس، والتقليل من مضان الخلفية، وصورة مع إشارة / الفئران خلفية عالية جداويتكون الإعلام والتوعية ^11.

العديد من الخصائص تجعل TIRFM أسلوب الاختيار لرصد الحويصلات ديناميات. على النقيض من ذلك الكمال وإشارة إلى الضوضاء نسبة عالية تسمح للكشف عن الإشارات منخفضة جدا مستمدة من الحويصلات واحدة. الحصول على الصور يعتمد على الشرائح الالكترونية في كل إطار يوفر القرار الزماني اللازم لاكتشاف عمليات ديناميكية للغاية. وأخيرا، فإن التعرض الحد الأدنى من الخلايا لضوء في أي طائرة أخرى في العينة يقلل بشدة الضيائية وتمكن تسجيل طويل دائم الوقت الفاصل ^12.

يبقى تحليل البيانات الجانب الأكثر تحديا وحاسم من هذه التقنية. إن أبسط طريقة لمراقبة الانصهار الحويصلة هي لقياس تراكم البروتينات مراسل فلوري على سطح الخلية، على مر الزمن ^13. كما يزيد من الانصهار، صافي الزيادة إشارة مضان كذلك. ومع ذلك، وهذه الطريقة قد يقلل من شأن هذه العملية، لا سيما في الخلايا الكبيرة وفي ظروف الراحة،لأن العمليات الإلتقام وphotobleaching من تعويض الزيادة في كثافة مضان بسبب حويصلة إيماس. طريقة بديلة هو اتباع كل الانصهار حدث واحد ^14. هذا الأسلوب الأخير هو حساس جدا ويمكن أن تكشف عن تفاصيل مهمة حول آليات الاندماج. ومع ذلك، فإنه يتطلب اختيار اليدوية الأحداث واحدة، لأن إجراءات مؤتمتة بالكامل لمتابعة الحويصلات وللتسجيل تذبذب إشاراتها الفلورسنت لا تتوفر دائما. مراقبة ديناميات الحويصلة تتطلب خلايا أخذ العينات في وتيرة عالية. وهذا يولد كمية كبيرة من البيانات التي بالكاد يمكن تحليلها يدويا.

على اقتراح من هذه الورقة هو تحسين تقنية التصوير TIRFM لرصد القاعدية وحفز الإفراج العصبي في خط الخلية العصبية SH-5YSY، ووصف، خطوة بخطوة، وهو إجراء المتقدمة في المختبر لتحليل البيانات، على حد سواء عند مستويات كلها خلية واحدة حويصلة.