Summary
細胞および組織中のタンパク質レベルは、多くの場合、緊密にタンパク質産生及びクリアランスのバランスによって調節される。光変換した後、蛍光減衰（FDAP）を使用して、タンパク質のクリアランス速度は、実験的にin vivoで測定することができる。
Abstract
タンパク質の安定性は、生物学の多くの側面に影響を与える、タンパク質のクリアランス速度を測定することは、生物学的システムへの重要な洞察を提供することができる。 FDAP実験では、生物内のタンパク質のクリアランスを測定することができる。目的のタンパク質は、photoconvertible蛍光タンパク質でタグ付けされ、インビボで発現され、photoconverted、経時photoconvertedシグナルの減少がモニターされる。データは、その後、タンパク質の半減期を決定するための適切なクリアランスモデルが取り付けられている。重要なのは、生物の異なる区画におけるタンパク質の集団のクリアランス動態コンパートメントマスクを適用することによって、別々に検査することができる。このアプローチは、ゼブラフィッシュの開発中に分泌されたシグナル伝達タンパク質の細胞内および細胞外の半減期を決定するために使用されてきた。ここでは、ゼブラフィッシュ胚におけるFDAP実験のためのプロトコルについて説明します。それのクリアランス速度を決定するFDAPを使用することが可能であるべきであるすべての光学的にアクセス可能な生物内の任意のタグ付けタンパク質。
Introduction
細胞および生物中のタンパク質のレベルは、製造及びクリアランス形成速度によって決定される。タンパク質半減期は数分から数日1-4の範囲とすることができる。多くの生物学的システムでは、重要なタンパク質の安定化またはクリアランスは、細胞活性に重要な影響を有している。細胞内のタンパク質の安定性の調節は、細胞周期の進行5,6、発達シグナリング7-9、アポトーシス10、および正常な機能およびニューロン11,12の維持に必要である。細胞外タンパク質の安定性は、組織内のモルフォゲン13,14、などの分泌タンパク質の分布と可用性に影響を与えます。
過去数十年にわたって、タンパク質の安定性は、主に放射パルス標識またはシクロヘキシミドチェイス実験15を使用して、細胞培養において評価されている。このようなパルスチェイス実験において、細胞を一過放射性アミノ酸の「パルス」に露出されている新たに合成されたタンパク質に組み込まれているか、又はそれらは、タンパク質合成を阻害するシクロヘキシミド、にさらされている酸前駆体。培養された細胞は、その後の異なる時点で、そしていずれかの免疫沈降は、（放射パルスチェイス実験において）、続いてオートラジオグラフィーまたはウェスタンブロッティング（シクロヘキシミド実験で）収集され、経時的タンパク質のクリアランスを定量化するために使用される。
従来のタンパク質安定性アッセイは、いくつかの欠点を有する。まず、これらのアッセイにおけるタンパク質は、しばしば、それらの内因性の環境において発現されるのではなく、異なる種由来の細胞組織培養において、時には。その安定性はコンテキスト依存であるタンパク質については、このアプローチには問題がある。第二に、時間をかけて、個々の細胞または生物におけるタンパク質のクリアランスに追従することができず、これらのアッセイからのデータは、異なる時点で細胞の異なる集団の平均を反映している。個々の細胞が開始している可能性があるのでタンパク質の異なる量、異なる時間に放射性標識またはシクロヘキシミドを取り上げてもよいし、異なるクリアランス速度を有していてもよく、そのような集計データは誤解を招く可能性がある。最後に、シクロヘキシミドチェイス実験の場合、タンパク質合成阻害剤の添加は、人為的にタンパク質の安定性16-18を変えることができ、意図しない生理学的効果を有することができる。これらの欠点は、光変換（FDAP）後に蛍光減衰を使用して（FDAP技術の限界のための説明を参照）、生物19-25で動的にタンパク質クリアランスを測定するためにphotoconvertibleタンパク質を利用して技術を避けることができる。
Photoconvertibleタンパク質は、その励起および発光特性は、光26の特定の波長に暴露された後に変更蛍光タンパク質である。 1つの一般的に使用される変形はDendra2、最初にEXを持つ「グリーン·ツー·赤」photoconvertibleタンパク質である緑色蛍光タンパク質と同様の引用及び発光特性が、UV光- 「光変換」 -そのへの曝露後に、励起/発光特性は、赤色蛍光タンパク質23,27と同様になる。重要なことは、光変換後に生成新しいタンパク質はphotoconvertedタンパク質の唯一のプールの光変換時の生産とクリアランスのデカップリングと観察を可能にphotoconvertedタンパク質と同じ励起/発光特性を持っていません。 photoconvertibleタンパク質と目的のタンパク質にタグを付けるため、そのまま、光学的にアクセス可能な生物中のタンパク質ラベルのパルスに便利な方法を提供します。
FDAPアッセイ（ 図1A）において、目的タンパク質はphotoconvertibleタンパク質でタグ付けされ、生体（ 図1B）で表さ。融合タンパク質はphotoconvertedされ、経時photoconvertedシグナルの減少はfluorescenによって監視されているCE顕微鏡（ 図1C）。データは、その後、融合タンパク質（ 図1D）の半減期を決定するために適切なモデルが取り付けられている。
ここで説明FDAPアッセイは、初期胚発生19時のゼブラフィッシュ胚における分泌されたシグナル伝達タンパク質の細胞外半減期を決定するために設計されました。しかし、このアプローチは、ライブイメージングを許容し、かつ任意のタグ付け、細胞内または細胞外タンパク質のクリアランスを監視するために使用することができる任意の透明なモデル生物に適合させることができる。ここに記載の技術の変形は、培養細胞20,23およびショウジョウバエ 22及びマウス21胚で行われている。
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Protocol
1. Photoconvertible融合構築し、ジェクトする絨毛膜を除去ゼブラフィッシュ胚の生成
- ミュラーらのように、融合タンパク質をコードするキャップされたmRNAを生成するために、インビトロ転写を使用し、その後、（説明を参照）緑色〜赤色photoconvertibleタンパク質に融合された関心対象のタンパク質を含有する機能性構築物を生成する。、2012 19。
- 1細胞期で約30ゼブラフィッシュ胚から絨毛膜を除去するためのプロナーゼを使用してください。あるいは、手動で鉗子28を使用して胚をdechorionate。
注：胚は、その後の画像化のために絨毛膜を除去する必要があります。所望ならば、胚は、撮像直前に、後で絨毛膜を通して注入及び絨毛膜を除去することができる。- 標準のゼブラフィッシュ胚培地19中でストレプトミセス·グリセウスからプロナーゼの5mg / mlのストック溶液を作る。プロテアーゼを溶解させるために室温で10分間静かに解決策を揺する。アリコート2メートル-20℃でマイクロチューブにLと凍結。
- 〜8ミリリットル胚培地を含む直径5cmのガラスまたはアガロースでコーティングされたプラスチック製のペトリ皿に移し1細胞期胚。皿に解凍したプロナーゼ原液の2ミリリットルを追加し、5から10分間、室温でインキュベートする。
- 絨毛膜を除去胚が破裂する原因となりますのいずれかとの接点として、空気やプラスチックに胚を近づけないようにしてください。胚培地で200ミリリットルのガラスビーカーを埋める。媒体中に沈めながら、シャーレを傾けてビーカーに胚を転送します。
- 胚がビーカーの底に沈殿した後、その後ビーカーに新鮮胚培地を注ぐ、胚培地のほとんどを注ぐ。ビーカーに注ぐ媒体の穏やかな旋回は、胚は彼らの弱体化絨毛膜を失うことになります。
- 手順を繰り返し1.2.4。
- フレームド先端がガラスパスツールピペットを用いてアガロースでコーティングされた注射ディッシュ29に絨毛膜を除去した胚を転送します。燃えるようなピペットチップは、負傷の胚からぎざぎざのエッジを防ぎます。
- mRNA及び3 kDaのAlexa488標識デキストランコンジュ29,30（;提案されたmRNAとのAlexa488デキストラン金額についての議論を参照してください。図1B）を共同注入する。切断が開始されるとさえmRNAの分布及び蛍光色素を確実にするために、細胞（卵黄ない）の中心に直接注入する。
注：Alexa488標識シグナルは、細胞内および細胞外の蛍光を区別するために、コンパートメントのマスクを生成するために、データ解析中に使用される。 - 転送は、1〜2％アガロースでコーティングされたウェルの胚培地で満たされた6ウェルプラスチック皿に胚を注入した。胚が後半球ステージ31（約5時間後に受精）に到達するまで28℃の暗所でインキュベートする。実体顕微鏡下で胚ごとに1〜2時間をチェックして、死亡した胚によって生成された破片を除去。
P 2.取付ゼブラフィッシュ胚倒立共焦点顕微鏡上hotoconversionとイメージング
- 一から五健全な胚を特定し、皿からそれらを削除するフレームド先端にガラスパスツールピペットを使用するために実体顕微鏡を使用してください。
- 穏やかに1×Danieauの胚培地中で溶融し、1％低融点アガロース（材料リストを参照のこと）（ 図2A）の約1 mlを含むマイクロ遠心チューブに胚を取り出す。
注：アガロースを40と42℃の間の温度を有するべきである。より高い温度は、胚を損傷する恐れがあります。 - いくつかのアガロースと一緒に戻ってピペットに胚を描画します。静かにグラスボトムディッシュ（ 図2B）のカバーガラス上にアガロースおよび胚を取り出してください。カバーガラスの厚さは共焦点顕微鏡上の目的と互換性があることを確認してください。
- 必要に応じて、ガラスピペットを再利用。ピペットの外に残留アガロースをきれいにし、上下にすばやく目詰まり、ピペット胚培地を防ぐために。この目的のための実体顕微鏡の隣にある胚培地の〜5ミリリットルで満たされた15ミリリットルチューブを置きます。
- 動物極（胚盤葉）はカバーガラスに対向するように胚を位置決めする金属プローブを使用する。アガロースは20〜30秒で固化するので、すぐに作業。胚のポジションを監視し、アガロースが硬化するまで、必要に応じて再調整する実体顕微鏡を使用してください。
- 胚の所望の数がマウントされるまで繰り返します2.1から2.4を繰り返します。
注：典型的な実験において、4つ、または5つの胚をそれぞれ含む4アガロース滴をカバーガラス上に容易に収まる。約16の胚を単理想的実験（ 図2C）中に撮像することができる。 - アガロースが固化した場合には、1X Danieauの胚培地とガラスボトムディッシュを埋める。
3. PhotoconvertingとPhotoconverted信号の減少を測定する
25Xまたは40X水客観Iゼブラフィッシュ胚の大きさ及び屈折率の適切な秒。水は5時間の実験中に蒸発するので、それは、水ではなく、実際の水と同じ屈折率液浸油を使用するのが最適です。イマージョンオイルを水（しない油）目的で使用するように設計されていることを確認。
- 対物レンズとカバーガラスとの間に油膜がイメージング中に異なる胚の位置にステージを移動するように破壊しないことを確実にする目的に液浸油の大滴を置く。ステージが移動したときの皿がずれないように、確実に、ステージ上にガラスボトムディッシュを置く。可能な場合は、28℃、ゼブラフィッシュの開発に最適な温度で加熱されたステージを使用しています。
- 共焦点顕微鏡のソフトウェアパッケージ内の各胚の位置を定義します。各胚のためのZ深度を調整し、各胚にほぼ同じ平面をターゲットにしようとします。
注：約30μm動物極からは、外出先でこの深さで、胚の被覆層を回避することができるので、外径の深さは、撮像領域が最大化され、光の散乱は最小である。 〜3.3ミクロンの厚さの単一の光スライスは十分なデータを提供します。 zスタック（セクション5を参照）を取得する必要はない。 - 実験中に2つの信号を収集する：Alexa488標識デキストラン共役がphotoconvertedされた後の融合タンパク質からの細胞外および細胞内の蛍光及び「赤」信号を分離するために、データ解析中に使用されるから「グリーン」信号を出力する。
- 488nmレーザーを使用してAlexa488エキサイト、および〜500と540nmの間で放出される蛍光を収集します。注：光変換した後、多くの緑色〜赤色photoconvertibleタンパク質（ 例えば 、Dendra2）は、543 nmのレーザーで励起すると、〜550〜650nmの蛍光を発することができる。使用photoconvertibleタンパク質に基づいて、必要に応じて調整します。
- 取得する「事前光変換「イメージ、および（5節を参照してください5時間の時間のコースに適した撮像条件と（ステップ3.2から）以前に定義された位置の各々ごとに10または20分間の映像に共焦点顕微鏡のソフトウェアを設定し、 考察）。
- 、融合タンパク質をphotoconvert 10X対物レンズに切り替えて、2分間100％出力で〜300-400 nmの励起フィルターとの水銀アークランプからのUV光に胚のグループを露出させる。 （セクション5を参照）均一の光変換を促進するためのz軸に沿って焦点を移す。液浸油は、光変換時の10倍の目的上に滴り落ちていないことを確認してください。
注：光変換時のフォーカスの移動は実験者の間で変動性を回避するために自動化することができる。 - すぐに光変換した後25Xや40X客観的に切り替えます。ステップ3.2から以前に定義された位置は正確であることを確認してください。料理はphotoconv中にシフトした場合ERSION、胚の位置を再定義します。
- ステップ3.4で作成したプログラムを起動し、イメージングは5時間続けることができる。光変換し、各胚のために撮影開始の間の経過時間に注意してください。
- 時折実験に確認してください。 Danieauの媒体のレベルを監視し、必要に応じてさらに追加する。それが失速している場合は、ソフトウェアを再起動します。
- 指数関数的に減少するモデルの漸近線を推定するデータ解析中に使用されるバックグラウンドの蛍光値を決定するために、実験にAlexa488標識デキストランはなく、mRNAを注入されたいくつかの胚を含む。また、その後のデータ解析中に使用される装置のノイズを決定するために、サンプルの非存在下での画像を取得する。
4. PyFDAPを使用したデータの分析
- 視覚的に各胚からの時間経過データセットを検査します。虚部中に死亡した胚からのデータセットを破棄photoconverted信号の非常に低いレベルを持っている、またはそれは珍しい見て、移動すると、（負傷または病気の胚の典型的な）で除停止した細胞の領域を含む大幅にシフトしたING、、。
注：時々、液浸油中の気泡またはその他のアーチファクトがそうでなければ、使用可能なデータ·セットに1つまたは2つの画像に表示されます。アーティファクトを含むすべての画像を注意してください。彼らは、後に破棄され、そのようなデータセットからの残りの時点では、まだ分析することができる。 - FDAPデータを分析するPythonベースのソフトウェアパッケージPyFDAPを使用してください。 PyFDAPは、各画像の平均細胞内および細胞外の赤色蛍光強度を測定し、指数関数的に減少する関数56（ 図3）を使用してデータをフィッティングすることにより半減期を算出する。
- PyFDAPをダウンロード（見る マテリアルリスト）。
- 細胞内および細胞外photoconverted信号（ 図3A、B）を分離するPyFDAP使用。私達細胞内のマスクを作成するために、厳密に細胞内でのAlexa488信号を、メール。平均外強度を計算する際に考慮されてからの細胞内のピクセルを防止するために、対応する赤色チャンネル画像にこのマスクを適用します。平均細胞内の強度を測定するために、マスクを反転。
- PyFDAPでは、ステップ4.2.2で生成されたマスクされた画像を表示する。視覚的にこれらの画像を検査し、マスクが正確に細胞外空間から細胞内（これは稀であるべきで区別しないでデータセットを破棄し、その細胞膜は、細胞外空間がマスクされた画像に含まれることに注意し、それらは、閾値を変化させることによって除去することができアルゴリズムまたはメンブレンマスクを導入することにより（ 例えば 、用いた膜-CFP））。また、ステップ4.1で識別された成果物（ 例えば 、浸漬油中の気泡）を含む任意の単一のイメージを捨てる。
- EACの平均外および細胞内の蛍光強度を計算するPyFDAPを使用H画像。 PyFDAPが合計の総画素数で除算マスクの外側にある画素の強度を合計することによって、これらの平均値を算出する。
- 以下の指数関数との蛍光データ（ 図3C）を取り付け：
tは時間後の光変換であり、C（t）は、tの任意の値での強度であり、c 0はを t = 0での強度であり、kは一定のクリアランス速度であり、y 0は、関数が蛍光として近づく漸近線である減少した（ 図1D）。Y 0は、ステップ3.8 19における測定結果に基づいて制約することができる。 - 以下の関係を用いてクリアランス速度定数（k）をから細胞外および細胞内タンパク質の半減期（τ）を計算するために使用PyFDAP。
退色、不注意による光変換、および光変換均一性を評価するために5.制御実験
- 評価退色
注：光退色は、目的のタンパク質のクリアランスに加えて、蛍光タンパク質の漂白特性を反映した蛍光強度のアーティファクトの減少を引き起こす可能性がある。- 可能な光退色を評価するために、撮像と撮像の間に20分間隔（ 図4）を有する第二の組の間に10分間隔でFDAPの一組の実験を行う。第4節で説明したようにPyFDAPを用いた実験の両方のセットからのデータを分析します。
- 10と20分間隔実験から半減期を比較してください。長い半減期20分間隔の実験からは、重要な光退色を示している。両実験からの半減期が同一である場合、photobleachingは重要な問題ではない。
- あるいは、すぐに光変換した後〜30一連の画像を取得することにより退色評価する。蛍光強度の有意な減少が有意な光退色を示している。
- 退色が検出された場合、より低いレーザーパワーを使用する撮像時間を減少させる、またはそれ以上の光安定photoconvertibleタンパク質32の使用を検討してください。
- 不注意な光変換を評価する。
注：Dendra2は488nmの照明27を用いphotoconvertedすることができる。 488nmレーザーで励起のAlexa488、目的のタンパク質の見かけの半減期段階3.3.1、不注意光変換ので、人為的な増加で説明するように、可能な場合である。しかし、我々は、他の33は、488nmの照明は、ゼブラフィッシュ胚における光変換の非効率的な方法であることを見出した。- 不注意な光変換を検出するために、ステップ5.1.1で説明した対照実験を使用して。 10と20分間隔実験から半減期を比較してください。 20分間隔の実験から、より短い半減期は大幅な不注意光変換を示している。両方の実験からの半減期が同一である場合には、不注意による光変換は重要な問題ではない。
- 不慮の光変換が検出された場合、誤ってDendra2をphotoconverting避けるために、下部488のレーザパワーより短い撮像時間を使用する。
- 光変換均一性を評価する。
注：光変換胚の動物極に向かって付勢されている場合、蛍光の減少は、より深い面（ 図5A）へのタンパク質の拡散または細胞運動によって影響される。- 光変換が均一であるかどうかを判断するには、（細胞外融合タンパク質を用いた実験のために）分泌さphotoconvertibleタンパク質または（細胞内の融合タンパク質を用いた実験のために）細胞質photoconvertibleタンパク質を発現する。いつものようにPhotoconvert、T鶏を80分間、20分毎に、胚盤葉のほとんどを包含するzスタックを取得する。
- 光変換は、動物極に向かって付勢されている場合は、より深い面での蛍光強度は、拡散または細胞運動（ 図5B）に経時的に増加します。不均一な光変換が検出された場合、光変換の間、胚に深い焦点を当てる。
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Representative Results
FDAPはゼブラフィッシュ胚19における細胞外シグナル伝達タンパク質の半減期を決定するために使用されてきた。これらのタンパク質のいずれか、スクイントは、胚形成34中胚葉遺伝子の発現を誘導する。目を細め-Dendra2は定量RT-PCRによっておよびin situハイブリダイゼーションアッセイ19 で示したように 、タグの付いていない目を細め同様のレベルで中内の遺伝子の発現を活性化する。胚のAlexa488デキストランおよびmRNAはスクイント-Dendra2をコードするとFDAPアッセイに供と共に同時注入した。経時的な細胞外photoconvertedシグナル強度の減少が明らかである（ 図4A）。 23の胚からの細胞外強度プロファイルはPyFDAPを使用して生成された。得られたデータは、一次クリアランス動態をPyFDAPに装着し、そして116分間の平均半減期τに 対応する1.00×10 -4 /秒の平均クリアランス速度定数kは 、決定された。類似の強度プロファイル撮影間隔が光退色または不注意な光変換する強度変化（ 図4B）に有意に寄与しなかったことを示唆し、10または20分としたときのクリアランス速度定数を得た。
図1.蛍光減衰した後、光変換（FDAP）の概要。（A）FDAP実験のワークフロー。 （B）mRNAの注射と1細胞期でのゼブラフィッシュ胚への蛍光色素。胚は、画像化の前に約5時間かけて発達するタンパク質は、mRNAから生成される。色素は細胞（緑の円）をラベル付けします。 （C）融合タンパク質を、UVパルスを用いphotoconvertedされ、経時photoconvertedシグナルの強度の減少がモニターされる。 （D）のデータが指数関数的に減少するが備わっていますクリアランス速度定数（k）と半減期（τ）を取得する機能。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
FDAP実験図2.取付ゼブラフィッシュの胚。（A）ゼブラフィッシュ胚（胚盤=ホワイト、卵黄=ブラック）（黄色）アガロース融解に胚培地（青）から転送されている。 （B）胚およびアガロース、ガラスボトムディッシュのカバーガラス上に配置されている。動物極にカバーガラスを向くように、胚は、手動で配置されている。ガラスボトムディッシュの断面が示されている。 （C）4胚各（皿に見下ろしビュー）を含むいくつかのアガロース滴のガラスボトムディッシュの概略図。w.jove.com/files/ftp_upload/52266/52266fig2large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
PyFDAP。（A）PyFDAPを使用して図3.データ解析は、細胞内のAlexa488信号（緑）から細胞内および細胞外のマスクを生成するために、大津しきい値処理アルゴリズム35を使用しています。分泌Dendra2融合タンパク質（スクイント-Dendra2 19）を発現する胚から（B）Photoconverted信号（赤）。平均的な細胞外および細胞内の蛍光強度（A）に示されるマスクを用いて計算した。胚の外側の空間は、黄色い円の外側のピクセルを破棄することにより、これらの計算から除外した。 FDAP実験から外強度データを表示する（C）PyFDAPスクリーン（黒を○指数関数的に減少関数（赤点線）を装備しクル）。細胞外の半減期は、赤の矢印で示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4.代表FDAP結果。（A）を発現する代表胚が直前に光変換（左端）と27、87、および287 分後に光変換目を細め-Dendra2を分泌した。 （B）は光退色や不注意な光変換（第5節参照）を制御するために、10または20分間隔での実験を行った（からミュラーらのデータ、2012 19）。 PyFDAPでは、細胞外の強度プロファイルは、生成された指数関数的に減少する機能を装備し、subtracによって正規化ティンフィットC 0値で各データ点と分割からフィットY 0の値。 10分からのデータ（黒、nは= 11）および20分（青、nは12）の間隔の実験は、その後、それぞれ、平均化した。エラーバーは標準偏差を示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
光変換均一性の評価図5。photoconvertedタンパク質が経時的により深い面内に拡散した場合に細胞外タンパク質の（A）不均一な光変換を誤って短い見かけの半減期をもたらすことができる。光変換が均一であるか否かを決定するために（B）、胚盤葉のほとんどを覆うzスタックは、いくつかの時点後photoconversで取得されるイオン。光変換が不均一（光散乱が高い平面より調光器表示されるように、より深い面を引き起こすことに注意してください）であった場合蛍光強度は時間をかけてより深い面で増加します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
FDAP実験の成功は、機能的なphotoconvertible融合タンパク質の生成に依存している。タンパク質をタグ付けすると、その局在性、溶解性、および安定性36-41を含む、その生物学的活性および/ または生物物理学的特性に影響を与えることができる。アクティブなものを見つけるために、いくつかの異なる融合構築物の活性を試験するために調製すること。本発明者らは、目的のタンパク質にphotoconvertibleタンパク質の位置を変更したり、より長いリンカーを用いて（ 例えば 、アミノ酸配列LGDPPVAT 19を使用して）融合タンパク質の活性を増強することができる。シグナル伝達タンパク質の場合には、融合タンパク質の活性は、標的遺伝子の19の発現を誘導する能力を試験することにより決定することができる。定量RT-PCR、またはin situハイブリダイゼーションは、標的遺伝子の発現19の良好な読み出しを提供する。ここで説明するプロトコルは、タンパク質の安定性を決定するために設計されていることに注意してください初期のゼブラフィッシュ胚およびその他のコンテキストでのタンパク質の安定性を評価するために修正が必要となる。
緑〜赤色photoconvertibleタンパク質Dendra2 27（ 図4）19ゼブラフィッシュFDAP実験に成功して使用されてきたが、他のオプションは26,42利用できます。融合タンパク質の凝集による潜在的なアーチファクトを回避するために、単量体photoconvertibleタンパク質を選択します。またFDAPで使用することができる光活性化タンパク質は、20-22,26をアッセイ。
FDAP実験を行う前に、プロトコルのいくつかの側面を最適化する必要がある。光変換の後に使用可能な信号を提供する最低の量を決定するために、mRNAの異なる量を注入する。 〜50μgのmRNAが適切な開始量がある。意味のある区画マスク（ 図3）を生成するために、Alexa488標識信号に十分に明るくなければなりません絶えず注入されたmRNAから生成される非photoconverted融合タンパク質からのシグナルに対抗。蛍光色素の最適量を見つけることのAlexa488デキストランの0.2と4 ngの間で注入する。最適な変換後の撮影条件を検索し、与えられた構築物を用いてすべての実験のために同じ条件を使用しています。 43を実践良い定量的イメージングを使用し、赤チャンネルで飽和画素を避けるために適切なダイナミックレンジを選択します。各融合タンパク質のための適切なイメージング間隔を決定する。非常に短い半減期を有するタンパク質は、より短い総時間にわたって、より頻繁な撮像を必要とし得る。使用する生物とphotoconvertibleタンパク質に基づいて最適な光変換技術を確立します。我々は、ステップ3.5において、水銀アークランプを用いたもの堅牢な光変換方法を説明するが、Dendra2も405 33または488 nmレーザー27 photoconvertedすることができる。
OneリーこのFDAPプロトコルのmitationは、目的のタンパク質の過剰発現が必要とされることである。過剰発現は、タンパク質のクリアランス動態14,44を変更する他の遺伝子の異常な発現を介して、例えば、タンパク質の安定性に影響を及ぼす可能性があります。目的のタンパク質は、シグナル伝達分子である場合、標的遺伝子の発現を遮断すること、タンパク質の安定性に影響を与えるかどうかを決定するために、シグナル伝達阻害剤の存在下での実験を行うことを検討してください。将来的には、内因性の発現エレメント45〜50の制御下でphotoconvertible融合物を発現するトランスジェニック胚を生成することが可能である。トランスジェニック胚は、十分な信号を生成する場合、非過剰発現コンテキストでFDAP実験は、おそらく全体の胚51における蛍光の減少を観察光シート顕微鏡を使用して、考えられる。
FDAPのさらに可能なアプリケーションは、メカニズムのTHAを調査含みtの安定性に対する異なる摂動の効果（ 例えば 、推定上のプロテアーゼの発現）、またはタンパク質修飾（ 例えば 、リン酸化）を調べることによって、タンパク質の安定性を調節する。例えば、スクイントの細胞外安定性を制御する要因は現在不明である。多く分泌される発生シグナルは、細胞外空間からスクイントおよび他のリガンドのクリアランスに貢献できる細胞52-55、により内在されている。内在化がブロックされたFDAP実験は、細胞外タンパク質のクリアランスを制御するメカニズムに関する情報を提供するかもしれない。
タンパク質の安定性15を測定するための従来のアッセイとは対照的に、FDAPは、タンパク質のクリアランスが、生体内で経時的にモニターすることができる顕微鏡ベースの代替手段を提供する。同様の方法は、ゼブラフィッシュ胚以外のモデル系におけるタンパク質のクリアランスをモニターするために使用されている20-23。このFDAPプロトコルは、ライブイメージングが可能である生物系の任意のタグ付けタンパク質の半減期を決定するように適合される可能性を有している。
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Disclosures
著者らは、開示する競合がない。
Acknowledgments
著者は、原稿上のコメントジェフリー·ファレル、ジェームズガニオン、そしてジェニファーバーグマンに感謝したいと思います。 KWRはFDAPアッセイの開発中に国立科学財団大学院研究フェローシッププログラムによってサポートされていました。この作品は、AFSへとPMにドイツ研究財団（エミー·ネータープログラム）、マックス·プランク協会、とヒューマン·フロンティア·サイエンス·プログラム（キャリア開発賞）からの補助金によってNIHからの助成金によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PyFDAP (download from the following website: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab) | Install and operate using the instructions provided on the PyFDAP website; PyFDAP is compatible with Linux, Mac, and Windows operating systems. | ||
| mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit | Life Technologies | AM1340 | To generate capped mRNA for injection into embryos |
| Alexa488-dextran conjugate, 3 kDa | Life Technologies | D34682 | Co-inject with mRNA to create intracellular and extracellular masks |
| 6-well plastic dish | BD Falcon | Incubate embryos in agarose-coated wells until ready for mounting | |
| Embryo medium | 250 mg/L Instant Ocean salt, 1 mg/L methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3 | ||
| Protease from Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos at the one-cell stage |
| 5 cm diameter glass Petri dish | For embryo dechorionation | ||
| 200 ml glass beaker | For embryo dechorionation | ||
| Microinjection apparatus | For injection of mRNA and dye into embryos at the one-cell stage | ||
| Stereomicroscope | For injecting and mounting embryos | ||
| 1x Danieau's medium | Dilute low melting point agarose and perform imaging in this medium; recipe: 0.2 mm filtered solution of 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.3 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7.2 | ||
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | For mounting embryos; use at a concentration of 1% in Danieau's medium: add 200 mg to 20 ml Danieau's medium, microwave until dissolved, then aliquot 1 ml into microcentrifuge tubes; aliquots can be stored at 4 °C, re-melted at 70 °C, and cooled to 40–42 °C when ready to use |
| Glass Pasteur pipette | Kimble Chase (via Fisher) | 63A53WT | For mounting embryos; flame the tip to prevent jagged edges from injuring embryos |
| Metal probe | For positioning embryos during mounting | ||
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | Use the appropriate cover glass thickness for your objective; part number listed here is for cover glass No. 1.5 |
| 15 ml tube filled with ~5 ml embryo medium | BD Falcon | For rinsing residual agarose from the Pasteur pipette | |
| Inverted laser scanning confocal microscope | A mercury arc lamp, 488 nm laser, 543 nm laser, and the appropriate filter sets are required | ||
| Heated stage | To maintain embryos at the optimal temperature of 28 °C during the experiment | ||
| Confocal software capable of time-lapse imaging | Must be able to define multiple positions and automatically image them at defined intervals | ||
| 25X or 40X water objective | Objective for imaging | ||
| 10X air objective | Objective for photoconversion | ||
| Immersion oil | Immersion oil with the same refractive index as water |
References
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