Detección de True IgE que expresan las células del linaje B de ratón
Summary
In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.
Abstract
B inmunoglobulina de linfocitos de cadena pesada (IgH) recombinación de cambio de clase (CSR) es un proceso en el que expresa inicialmente IgM cambia a otros isotipos de IgH, tales como IgA, IgE e IgG. Medición de la IgH CSR in vitro es un método clave para el estudio de una serie de procesos biológicos que van desde la recombinación y reparación del ADN a los aspectos de la inmunología molecular y celular. Ensayo de vitro RSE implica la superficie de medición expresión Ig de citometría de flujo en células B activadas. Si bien la medición de IgA e IgG subclases es sencillo, la medición de IgE por este método es problemático debido a la IgE soluble unión a FcεRII / CD23 expresado en la superficie de las células B activadas. Aquí se describe un procedimiento único para la medición precisa de IgE productoras de células B de ratón que han sido objeto de la RSE en la cultura. El método se basa en la escisión de tripsina-mediada de complejos IgE-CD23 en la superficie celular, lo que permite la detección de células de linaje B productoras de IgE por CYtinción toplasmic. Este procedimiento ofrece una solución conveniente para el análisis de citometría de flujo de la RSE a la IgE.
Introduction
Durante inmunoglobulina de cadena pesada (IgH) recombinación de cambio de clase (CSR) en ratones y seres humanos, la IgH μ exones de la región constante (Cμ) se eliminan y sustituyen por uno de varios conjuntos de los exones de la región constante aguas abajo (C H s) (por ejemplo Cγ, Cε, y Cα), resultando en un cambio de la producción de IgM a la producción de otras clases de Ig (por ejemplo, IgG, IgE, o IgA). RSE se produce dentro de conmutación (S), que son regiones 1-10 kb secuencias localizadas 5 'a cada conjunto de C H 1 s. La activación inducida por citidina deaminasa (AID) enzima inicia la RSE a través de la actividad de citidina deamination.
La IgE es un mediador clave de la enfermedad alérgica 2 y una mayor comprensión de cómo se produce y regulada puede abrir las puertas a nuevos enfoques terapéuticos para la enfermedad atópica IgE. En los ratones y los seres humanos, IgE es el isotipo Ig más estrechamente regulado. IgE normalmente se detecta en niveles miles de times menor que otro IgH isotipos 3, pero puede ser muy elevado en estados de enfermedad 4. Sin embargo, la RSE a la IgE no se conoce bien. In vitro la activación de células B usando IL-4 en combinación con anti-CD40 o LPS, induce CSR tanto a IgG1 e IgE 5. Las células B activadas expresan el receptor de baja afinidad IgE FcεRII / CD23 2,6, que se une la IgE soluble secretada en la cultura después de la RSE. Por lo tanto, al analizar con citometría de flujo, las células B con receptor de IgE unida mancha similar a las células B que expresan endógenamente IgE 7. Aunque se sabe que el ratón B células expresan el receptor de baja afinidad IgG FcγRIIB1 (CD32) 8, en nuestra experiencia, no parece interferir con la medición del cambio de clase a IgG1. Sin embargo, en la medición de conmutación IgE después de la activación de las células B en la cultura, unida a la superficie específica IgE puede oscurecer el análisis. Con los métodos de tinción comunes, las células no expresan IgE tiñen positivamente para IgE.
Esbozado aquí es una estrategia que se ha utilizado para llevar a cabo ensayos de RSE y detectar verdaderas células IgE-B que expresan de ratones 9-11. El tratamiento de células B activadas con tripsina, un reactivo de laboratorio común para digerir las proteínas, elimina unido a la superficie tanto citofílicos y la membrana IgE. Permeabilización posterior y tinción citoplasmática de IgE por lo tanto revela las verdaderas células productoras de IgE.
Protocol
Representative Results
Discussion
La estimulación de células B de ratón esplénica en cultivo con anti-CD40 y IL-4 simulará T helper de tipo 2 (T H 2) las interacciones, el cambio de clase alentador IgG1 e IgE 5. Las células B pueden ser activados para la RSE en el contexto de esplenocitos totales 12 o células B esplénicas purificadas 11. Como se ha indicado en el protocolo (etapa 2.3), el enriquecimiento de células B es opcional, y es a discreción del experimentador para determinar si sería benefici…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DRW es apoyado por subvenciones del NIH AI089972 y AI113217, y por el de la mucosa Estudios de Inmunología del equipo, y tiene una concesión de carrera para los científicos médicos del Fondo Burroughs Wellcome.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Mouse IgE FITC | BD Pharmingen | 553415 | clone R35-72 |
| Rat Anti-Mouse IgG1 PE | BD Pharmingen | 550083 | clone A85-1 |
| Methanol | BDH | BDH1135-4LP | Keep at -20 °C |
| Falcon Cell Strainer 40 µm Nylon | Corning | 352340 | |
| Falcon Cell Strainer 70 µm Nylon | Corning | 352350 | |
| Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5 | eBioscience | 45-4052-82 | clone RA3-6B2 |
| anti-Mouse/Rat CD40 | eBioscience | 16-0402-85 | clone HM40-3 |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| MEM-NEAA (100X) | Gibco | 11140-050 | |
| Phosphate Buffered Saline (10X) | Lifetechnologies (Corning) | 46-013-CM | |
| MACS CD45R (B220) microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-501 | |
| MACS purification column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| IL-4 | PeproTech | 214-14 | Reconstitute in water or 0.1% BSA |
| Formalin Solution, Neutral Buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128-4L | |
| Trypsin-EDTA Solution (10X) | Sigma Aldrich | T4174-100mL | 5.0g Trypsin, 2.0g EDTAŸ4Na per Liter of 0.9% NaCl |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100mL | 10,000U Penicillin; 10 mg/mL Streptomycin (100X) |
| L-Glutamine 200mM | Sigma Aldrich | G7513 | |
| 2-mercaptoethanol (99%) | Sigma Aldrich | M6250-100mL | |
| Red cell lysis buffer | Sigma Aldrich | R7757 | |
| Rat Anti-Mouse IgM RPE/cy7 | SouthernBiotech | 1140-17 | clone 1B4B1 |
| HyClone Fetal Calf Serum | Thermo | SH30910.03 | |
| B cell Stimulation media | B cell stimulation media consists of RPMI with fetal calf serum (15%), 20 mM HEPES, 1X MEM-NEAA, 2.0mM L-glutamine, 1X Penicillin-Streptomycin (Penicillin:100 U/ml, Streptomycin: 100 µg/ml), Beta-mercaptoethanol (7 µL/L), IL-4 (20 ng/mL), and anti-CD40 (1 µg/mL) |
Referências
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