Detecção de True IgE-expressando Rato B células da linhagem
Summary
In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.
Abstract
B imunoglobulina linfócitos cadeia pesada (HGI) recombinação mudança de classe (CSR) é um processo em que, inicialmente, expressa IgM muda para outros isotipos CMI, tais como IgA, IgE e IgG. Medição de IgH RSE in vitro é um método fundamental para o estudo de uma série de processos biológicos variam de recombinação e reparação do ADN de aspectos da imunologia molecular e celular. Ensaio in vitro RSE envolve a superfície de medição de citometria de fluxo a expressão de Ig em células B activadas. Embora a medição de IgA e IgG subclasses é simples, medição de IgE por este método é problemático devido à ligação de IgE a FceRII solúvel / CD23 expresso na superfície de células B activadas. Aqui, descrevemos um processo único para a medição precisa de IgE células B de ratinho produtora que tenham sido submetidos a RSE em cultura. O método baseia-se na clivagem mediada por tripsina de complexos IgE-CD23 na superfície das células, permitindo a detecção de células produtoras de IgE da linhagem B por cycoloração toplasmic. Este procedimento oferece uma solução conveniente para a análise de citometria de fluxo de CSR para IgE.
Introduction
Durante cadeia pesada de imunoglobulina (IgH) recombinação mudança de classe (CSR) em ratos e seres humanos, o IgH μ exons região constante (Cμ) são eliminados e substituídos por um dos vários conjuntos de jusante exons região constante (C H s) (por exemplo, Cy, Cε, e Ca), resultando numa passagem da produção de IgM para a produção de outras classes de Ig (por exemplo, IgG, IgE, ou IgA). RSE ocorre dentro de regiões de troca (S), que são sequências de 1-10 kb localizado 5 'em cada conjunto de C H 1 s. A enzima Activação Induzida citidina-desaminase (AID) inicia RSE através da actividade de citidina de desaminação.
IgE é um mediador chave da doença alérgica 2 e uma maior compreensão de como IgE é produzida e regulamentada pode abrir as portas para novas abordagens terapêuticas para a doença atópica. Em ratos e seres humanos, IgE é o isotipo Ig mais rigidamente controlado. IgE é normalmente detectada em níveis milhares de times menos do que outros isotipos de IgH 3, mas pode ser muito elevado em estados de doença 4. No entanto, a RSE para IgE é completamente compreendida. In vitro a activação de células B com IL-4 em combinação com anti-CD40 ou LPS, induz RSE para ambos IgG1 e IgE 5. Células B ativadas expressar a baixa afinidade receptor IgE FceRII / CD23 2,6, que liga IgE solúvel secretada em cultura após CSR. Portanto, quando a análise por citometria de fluxo, as células B com receptor de IgE ligado a mancha de modo semelhante às células B expressando IgE 7 endogenamente. Embora se saiba que o mouse B células expressam a baixa afinidade IgG receptor FcγRIIB1 (CD32) 8, em nossa experiência, não parece interferir com a medição da classe de comutação para IgG1. No entanto, quando se mede a IgE de comutação após a activação das células B em cultura, não específica ligada à superfície IgE pode obscurecer a análise. Com métodos de coloração comuns, as células não-IgE-expressando manchar positivamente para IgE.
Esboçado aqui é uma estratégia que tem sido utilizada para realizar ensaios de RSE e detectar células B expressando IgE verdadeiros de ratos 9-11. O tratamento de células B activadas com tripsina, um reagente de laboratório comum para digerir a proteína, remove tanto cytophylic superfície e ligada à membrana de IgE. Permeabilização e subsequente coloração citoplasmática para IgE revela, assim, as células produtoras de IgE verdadeiros.
Protocol
Representative Results
Discussion
A estimulação de células B do baço de rato em cultura com anti-CD40 e IL-4 irá simular tipo T helper 2 (T H 2) interacções, troca de classe encorajador IgG1 e IgE 5. As células B podem ser ativados para a RSE no âmbito do total esplenocitos 12 ou células B do baço como purificados 11. Como foi observado no protocolo (passo 2.3), o enriquecimento de células B é opcional, e fica ao critério do experimentador para determinar se seria benéfico. Separação magnétic…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DRW é suportado pelo NIH bolsas AI089972 e AI113217, e pela mucosa Estudos Imunologia Team, e detém um Prémio Carreira para médicos cientistas do Fundo Wellcome Burroughs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Mouse IgE FITC | BD Pharmingen | 553415 | clone R35-72 |
| Rat Anti-Mouse IgG1 PE | BD Pharmingen | 550083 | clone A85-1 |
| Methanol | BDH | BDH1135-4LP | Keep at -20 °C |
| Falcon Cell Strainer 40 µm Nylon | Corning | 352340 | |
| Falcon Cell Strainer 70 µm Nylon | Corning | 352350 | |
| Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5 | eBioscience | 45-4052-82 | clone RA3-6B2 |
| anti-Mouse/Rat CD40 | eBioscience | 16-0402-85 | clone HM40-3 |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| MEM-NEAA (100X) | Gibco | 11140-050 | |
| Phosphate Buffered Saline (10X) | Lifetechnologies (Corning) | 46-013-CM | |
| MACS CD45R (B220) microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-501 | |
| MACS purification column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| IL-4 | PeproTech | 214-14 | Reconstitute in water or 0.1% BSA |
| Formalin Solution, Neutral Buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128-4L | |
| Trypsin-EDTA Solution (10X) | Sigma Aldrich | T4174-100mL | 5.0g Trypsin, 2.0g EDTAŸ4Na per Liter of 0.9% NaCl |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100mL | 10,000U Penicillin; 10 mg/mL Streptomycin (100X) |
| L-Glutamine 200mM | Sigma Aldrich | G7513 | |
| 2-mercaptoethanol (99%) | Sigma Aldrich | M6250-100mL | |
| Red cell lysis buffer | Sigma Aldrich | R7757 | |
| Rat Anti-Mouse IgM RPE/cy7 | SouthernBiotech | 1140-17 | clone 1B4B1 |
| HyClone Fetal Calf Serum | Thermo | SH30910.03 | |
| B cell Stimulation media | B cell stimulation media consists of RPMI with fetal calf serum (15%), 20 mM HEPES, 1X MEM-NEAA, 2.0mM L-glutamine, 1X Penicillin-Streptomycin (Penicillin:100 U/ml, Streptomycin: 100 µg/ml), Beta-mercaptoethanol (7 µL/L), IL-4 (20 ng/mL), and anti-CD40 (1 µg/mL) |
Referências
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