איתור של True IgE להביע תאי Lineage העכבר B
Summary
In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.
Abstract
שרשרת כבדה (IGH) רקומבינציה אימונוגלובולין הלימפוציטים B מתג כיתה (CSR) היא תהליך שבו הביע תחילה IgM עובר לisotypes IGH האחר, כגון IgA, IgE וIgG. מדידה של IGH CSR במבחנה היא שיטת מפתח למחקר של מספר תהליכים הביולוגיים הנעים בין רקומבינציה DNA ותיקון להיבטים של אימונולוגיה מולקולרית ותאית. Assay במבחנה CSR כרוך ביטוי איג משטח מדידת הזרימה cytometric על תאי B מופעלים. בעוד מדידת subclasses IgA וIgG היא פשוטה, המדידה של IgE בשיטה זו היא בעייתית בשל IgE המסיס מחייב FcεRII / CD23 הביע על פני השטח של תאי B מופעלים. כאן אנו מתארים הליך ייחודי למדידה מדויקת של IgE-ייצור B עכבר תאים שעברו אחריות חברתית בתרבות. השיטה מבוססת על מחשוף בתיווך טריפסין של מתחמי IgE-CD23 על משטחי תא, ומאפשרת לגילוי של IgE-ייצור תאי B שושלת ידי CYצביעת toplasmic. הליך זה מציע פתרון נוח לניתוח הזרימה cytometric של CSR לIgE.
Introduction
במהלך שרשרת כבדה רקומבינציה אימונוגלובולינים (IGH) מתג כיתה (CSR) בעכברים ובבני אדם, IGH μ אקסונים קבועים אזור (Cμ) יימחקו ויוחלפו על ידי אחד מכמה סטים של אקסונים אזור קבועים במורד הזרם (ים H C) (למשל Cγ, Cε, וCα), וכתוצאה מכך מתג מייצור IgM לייצור של מעמדות אחרות איג (למשל IgG, IgE, או IgA). CSR מתרחש בתוך אזורי מתג (S), שהם 1-10 רצפי kb ממוקמים 5 'לכל קבוצה של C H של 1. אנזים ההפעלה-induced Cytidine deaminase (AID) יוזם אחריות חברתית באמצעות פעילות דיאמינציה cytidine.
IgE הוא מתווך עיקרי של מחלה אלרגית 2 והבנה טובה יותר של איך IgE מיוצר ומוסדר עשוי לפתוח דלתות לגישות טיפוליות חדשות למחלה אטופית. בעכברים ובבני אדם, IgE הוא אלוטיפ איג המוסדר ביותר בחוזקה. IgE בדרך כלל מתגלה באלפי רמות של times פחות מIGH האחר isotypes 3, אבל יכול להיות מורמים מאוד במצבי מחלה 4. עם זאת, אחריות חברתית לIgE הוא הבין באופן חלקי. הפעלה במבחנה של תאי B באמצעות IL-4 בשילוב עם שני אנטי CD40 או LPS, גורם לשני CSR IgG1 וIgE 5. תאי B מופעלים לבטא את קולט הנמוך זיקת IgE FcεRII / CD23 2,6, אשר נקשר IgE המסיס מופרש בתרבות לאחר CSR. לכן בעת ניתוח עם זרימת cytometry, תאי B עם כתם IgE-מחויב קולט בדומה לתאי B אופן אנדוגני להביע 7 IgE. אמנם ידוע כי B עכבר תאים לבטא את הזיקה הנמוכה IgG קולט FcγRIIB1 (CD32) 8, בניסיון שלנו זה לא מופיע להפריע למדידה של מיתוג בכיתה לIgG1. עם זאת, בעת מדידת מיתוג IgE לאחר הפעלת תא B בתרבות, IgE מחויב-פני השטח ספציפיים עלול לטשטש את הניתוח. עם שיטות צביעה משותפות, תאים שאינם IgE להביע להכתים חיובי עבור IgE.
מתואר כאן היא אסטרטגיה שנוצלה לביצוע מבחני אחריות חברתית ולזהות תאי B להביע IgE אמיתיים מעכברים 9-11. טיפול בתאי B מופעלים עם טריפסין, מגיב מעבדה משותפת לעיכול חלבון, מסיר משטח מחויב שני cytophylic וקרום IgE. permeabilization לאחר והצביעה לIgE cytoplasmic כך חושפים את התאים מייצרי IgE האמיתיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
גירוי של תאי B טחול עכבר בתרבות עם אנטי CD40 וIL-4 יהיה לדמות סוג T מסייע 2 (T H 2) אינטראקציות, מיתוג כיתה מעודד לIgG1 וIgE 5. תאי B יכולים להיות מופעלים על אחריות חברתית בהקשר של splenocytes הכולל של 12 או תאי B טחול מטוהרים 11. כפי שצוין בפרוטוקול (שלב 2.3), העשרת תאי B…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DRW נתמך על ידי מענקי NIH AI089972 וAI113217, ועל ידי הרירי אימונולוגיה מחקרי צוות, ופרס קריירה עבור מדענים רפואיים מWellcome בורוז הקרן מחזיק.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Mouse IgE FITC | BD Pharmingen | 553415 | clone R35-72 |
| Rat Anti-Mouse IgG1 PE | BD Pharmingen | 550083 | clone A85-1 |
| Methanol | BDH | BDH1135-4LP | Keep at -20 °C |
| Falcon Cell Strainer 40 µm Nylon | Corning | 352340 | |
| Falcon Cell Strainer 70 µm Nylon | Corning | 352350 | |
| Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5 | eBioscience | 45-4052-82 | clone RA3-6B2 |
| anti-Mouse/Rat CD40 | eBioscience | 16-0402-85 | clone HM40-3 |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| MEM-NEAA (100X) | Gibco | 11140-050 | |
| Phosphate Buffered Saline (10X) | Lifetechnologies (Corning) | 46-013-CM | |
| MACS CD45R (B220) microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-501 | |
| MACS purification column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| IL-4 | PeproTech | 214-14 | Reconstitute in water or 0.1% BSA |
| Formalin Solution, Neutral Buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128-4L | |
| Trypsin-EDTA Solution (10X) | Sigma Aldrich | T4174-100mL | 5.0g Trypsin, 2.0g EDTAŸ4Na per Liter of 0.9% NaCl |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100mL | 10,000U Penicillin; 10 mg/mL Streptomycin (100X) |
| L-Glutamine 200mM | Sigma Aldrich | G7513 | |
| 2-mercaptoethanol (99%) | Sigma Aldrich | M6250-100mL | |
| Red cell lysis buffer | Sigma Aldrich | R7757 | |
| Rat Anti-Mouse IgM RPE/cy7 | SouthernBiotech | 1140-17 | clone 1B4B1 |
| HyClone Fetal Calf Serum | Thermo | SH30910.03 | |
| B cell Stimulation media | B cell stimulation media consists of RPMI with fetal calf serum (15%), 20 mM HEPES, 1X MEM-NEAA, 2.0mM L-glutamine, 1X Penicillin-Streptomycin (Penicillin:100 U/ml, Streptomycin: 100 µg/ml), Beta-mercaptoethanol (7 µL/L), IL-4 (20 ng/mL), and anti-CD40 (1 µg/mL) |
Referências
- Chaudhuri, J., et al. Evolution of the immunoglobulin heavy chain class switch recombination mechanism. Advances in immunology. 94, 157-214 (2007).
- Gould, H. J., Sutton, B. J. IgE in allergy and asthma today. Nature reviews. Immunology. 8, 205-217 (2008).
- Winter, W. E., Hardt, N. S., Fuhrman, S. . Immunoglobulin E. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 124 (9), 1382-1385 (2000).
- Ozcan, E., Notarangelo, L. D., Geha, R. S. Primary immune deficiencies with aberrant IgE production. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 122, 1054-1062 (2008).
- Bacharier, L. B., Geha, R. S. Molecular mechanisms of IgE regulation. The Journal of allergy and clinical immunology. 105, 547-558 (2000).
- Yokota, A., et al. Two species of human Fc epsilon receptor II (Fc epsilon RII/CD23): tissue-specific and IL-4-specific regulation of gene expression. Cell. 55 (4), 611-618 (1988).
- Boboila, C., et al. Alternative end-joining catalyzes class switch recombination in the absence of both Ku70 and DNA ligase 4. The Journal of experimental medicine. 207, 417-427 (2010).
- Nimmerjahn, F., Ravetch, J. Fcgamma receptors as regulators of immune responses. Nature reviews. Immunology. 8 (1), 34-47 (2008).
- Callen, E., et al. 53BP1 mediates productive and mutagenic DNA repair through distinct phosphoprotein interactions. Cell. 153 (6), 153-1280 (2013).
- Wesemann, D. R., et al. Reprogramming IgH isotype-switched B cells to functional-grade induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13745-13750 (2012).
- Wesemann, D., et al. Immature B cells preferentially switch to IgE with increased direct Sµ to Sε recombination. The Journal of experimental medicine. 208 (13), 2733-2746 (2011).
- Zarrin, A. A., et al. An evolutionarily conserved target motif for immunoglobulin class-switch recombination. Nature immunology. 5, 1275-1281 (2004).
- Fan, G., et al. Development of a class-specific polyclonal antibody-based indirect competitive ELISA for detecting fluoroquinolone residues in milk. Journal of Zhejiang University. Science. B. 13 (7), 545-554 (2012).
- Perez, O., Krutzik, P., Nolan, G. Flow cytometric analysis of kinase signaling cascades. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 263, 67-94 (2004).
- Jamur, M., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 588, 55-61 (2010).
- Ishizaka, T., Ishizaka, K. Mechanisms of passive sensitization. IV. Dissociation of IgE molecules from basophil receptors at acid pH. Journal of immunology (Baltimore, MD. : 1950). 112 (3), 1078-1084 (1950).
- Erazo, A., et al. Unique Maturation Program of the IgE Response In Vivo. Immunity. 26, 191-203 (2007).
- Xiong, H., Dolpady, J., Wabl, M., Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. Sequential class switching is required for the generation of high affinity IgE antibodies. Journal of Experimental Medicine. 209, 353-364 (2012).
- Yang, Z., Sullivan, B., Allen, C. Fluorescent in vivo detection reveals that IgE(+) B cells are restrained by an intrinsic cell fate predisposition. Immunity. 36 (5), 857-872 (2012).
- Berkowska, M. A., et al. Human IgE(+) B cells are derived from T cell-dependent and T cell-independent pathways. The Journal of allergy and clinical immunology. , (2014).
- He, J. -. S., et al. The distinctive germinal center phase of IgE+ B lymphocytes limits their contribution to the classical memory response. The Journal of experimental medicine. 210 (12), 2755-2771 (2013).
- Keegan, A., Fratazzi, C., Shopes, B., Baird, B., Conrad, D. Characterization of new rat anti-mouse IgE monoclonals and their use along with chimeric IgE to further define the site that interacts with Fc epsilon RII and Fc epsilon RI. Molecular immunology. 28 (10), 1149-1154 (1991).
