Detectie van True IgE-expressie muis B Lineage Cellen
Summary
In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.
Abstract
B lymfocyten immunoglobuline zware keten (IgH) klasse switch recombinatie (CSR) is een werkwijze waarbij aanvankelijk uitgedrukt IgM schakelaars andere IgH isotypen, zoals IgA, IgE en IgG. Meting van IgH CSR in vitro is een belangrijke werkwijze voor de studie van een aantal biologische processen gaande van DNA recombinatie en herstel aspecten van moleculaire en cellulaire immunologie. In vitro CSR bepaling omvat de flowcytometrische meetoppervlak Ig expressie op geactiveerde B-cellen. Hoewel meting van IgA en IgG subklassen is eenvoudig, meting van IgE deze werkwijze problematisch vanwege oplosbaar IgE binding aan FceRII / CD23 op het oppervlak van geactiveerde B-cellen. Hier beschrijven wij een unieke procedure voor nauwkeurige meting van IgE-producerende muizen B-cellen die CSR hebben ondergaan in kweek. De methode is gebaseerd op trypsine gemedieerde klieving van IgE-CD23 complexen aan celoppervlakken, waardoor detectie van IgE-producerende B afkomstcellen door cytoplasmic kleuring. Deze procedure biedt een handige oplossing voor flowcytometrische analyse van MVO aan IgE.
Introduction
Tijdens de zware keten van immunoglobuline (IgH-) klasse switch recombinatie (MVO) in muizen en mensen, de IgH- μ constant gebied exons (Cp) worden geschrapt en vervangen door een van de verschillende sets van downstream constant gebied exons (C H s) (bijv Cv, Ce en Ca), resulterend in een omschakeling van de productie van IgM tot de productie van andere Ig klassen (bijvoorbeeld IgG, IgE of IgA). MVO plaatsvindt binnen schakelaar (S) regio's, die 1-10 kb sequenties 5 'om elke set van C H s 1 zijn. De Activation-Induced cytidinedeaminase (AID) enzym initieert MVO via cytidine deaminering activiteit.
IgE is een belangrijke mediator van allergische aandoeningen 2 en een beter begrip van hoe IgE wordt geproduceerd en gereguleerd kan deuren openen naar nieuwe therapeutische benaderingen van atopische aandoeningen. Bij muizen en mensen, IgE is het meest strak gereguleerd Ig isotype. IgE wordt normaal gedetecteerd in gehalten duizenden times minder dan andere IgH isotypen 3, maar kan sterk worden verhoogd bij ziektetoestanden 4. Echter, CSR IgE is onvolledig begrepen. In vitro activatie van B-cellen met IL-4 in combinatie met ofwel anti-CD40 of LPS induceert CSR zowel IgG1 en IgE 5. Geactiveerde B-cellen brengen de lage affiniteit IgE-receptor FceRII / CD23 2,6, die bindt oplosbaar IgE uitgescheiden in de cultuur na MVO. Dus bij de analyse met flowcytometrie, B cellen met receptor gebonden IgE vlek dezelfde cellen endogeen tot expressie IgE 7b. Hoewel bekend is dat de muis B-cellen brengen lage affiniteit IgG FcγRIIB1 receptor (CD32) 8, in onze ervaring blijkt niet te interfereren met de meting van klasse omschakeling naar IgG1. Echter, bij het meten van IgE omschakelen bij B-celactivering in kweek, niet-specifieke oppervlakte-IgE kan de analyse belemmeren. Gemeenschappelijke kleuringen, niet-IgE tot expressie brengende cellen te kleuren positief voor IgE.
Hier geschetst is een strategie die is gebruikt voor CSR assays true-IgE tot expressie B-cellen voeren en sporen van muizen 9-11. Behandeling van geactiveerde B-cellen met trypsine, een gemeenschappelijk laboratorium reagens om eiwitten te verteren, verwijdert zowel cytophylic en membraangebonden oppervlak IgE. Na permeabilisatie en kleuring voor cytoplasmatische IgE onthult dus de ware IgE-producerende cellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stimulatie van de muis milt B-cellen in cultuur met anti-CD40 en IL-4 zal simuleren T helper type 2 (T H 2) interacties, bemoedigende klasse omschakeling naar IgG1 en IgE 5. B-cellen kunnen worden geactiveerd voor CSR in met de totale splenocyten 12 of gezuiverde milt B-cellen 11. Zoals in het protocol (stap 2.3), B-cel verrijking is optioneel en is ter beoordeling van de onderzoeker als het zou gunstig bepalen. Positieve magnetische scheiding van B-cellen met CD45R (B220) -ge…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DRW wordt ondersteund door NIH subsidies AI089972 en AI113217, en door de Mucosal Immunologie Studies Team, en heeft een Career Award voor Medische Wetenschappers van de Burroughs Wellcome Fonds.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Mouse IgE FITC | BD Pharmingen | 553415 | clone R35-72 |
| Rat Anti-Mouse IgG1 PE | BD Pharmingen | 550083 | clone A85-1 |
| Methanol | BDH | BDH1135-4LP | Keep at -20 °C |
| Falcon Cell Strainer 40 µm Nylon | Corning | 352340 | |
| Falcon Cell Strainer 70 µm Nylon | Corning | 352350 | |
| Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5 | eBioscience | 45-4052-82 | clone RA3-6B2 |
| anti-Mouse/Rat CD40 | eBioscience | 16-0402-85 | clone HM40-3 |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| MEM-NEAA (100X) | Gibco | 11140-050 | |
| Phosphate Buffered Saline (10X) | Lifetechnologies (Corning) | 46-013-CM | |
| MACS CD45R (B220) microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-501 | |
| MACS purification column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| IL-4 | PeproTech | 214-14 | Reconstitute in water or 0.1% BSA |
| Formalin Solution, Neutral Buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128-4L | |
| Trypsin-EDTA Solution (10X) | Sigma Aldrich | T4174-100mL | 5.0g Trypsin, 2.0g EDTAŸ4Na per Liter of 0.9% NaCl |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100mL | 10,000U Penicillin; 10 mg/mL Streptomycin (100X) |
| L-Glutamine 200mM | Sigma Aldrich | G7513 | |
| 2-mercaptoethanol (99%) | Sigma Aldrich | M6250-100mL | |
| Red cell lysis buffer | Sigma Aldrich | R7757 | |
| Rat Anti-Mouse IgM RPE/cy7 | SouthernBiotech | 1140-17 | clone 1B4B1 |
| HyClone Fetal Calf Serum | Thermo | SH30910.03 | |
| B cell Stimulation media | B cell stimulation media consists of RPMI with fetal calf serum (15%), 20 mM HEPES, 1X MEM-NEAA, 2.0mM L-glutamine, 1X Penicillin-Streptomycin (Penicillin:100 U/ml, Streptomycin: 100 µg/ml), Beta-mercaptoethanol (7 µL/L), IL-4 (20 ng/mL), and anti-CD40 (1 µg/mL) |
Referências
- Chaudhuri, J., et al. Evolution of the immunoglobulin heavy chain class switch recombination mechanism. Advances in immunology. 94, 157-214 (2007).
- Gould, H. J., Sutton, B. J. IgE in allergy and asthma today. Nature reviews. Immunology. 8, 205-217 (2008).
- Winter, W. E., Hardt, N. S., Fuhrman, S. . Immunoglobulin E. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 124 (9), 1382-1385 (2000).
- Ozcan, E., Notarangelo, L. D., Geha, R. S. Primary immune deficiencies with aberrant IgE production. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 122, 1054-1062 (2008).
- Bacharier, L. B., Geha, R. S. Molecular mechanisms of IgE regulation. The Journal of allergy and clinical immunology. 105, 547-558 (2000).
- Yokota, A., et al. Two species of human Fc epsilon receptor II (Fc epsilon RII/CD23): tissue-specific and IL-4-specific regulation of gene expression. Cell. 55 (4), 611-618 (1988).
- Boboila, C., et al. Alternative end-joining catalyzes class switch recombination in the absence of both Ku70 and DNA ligase 4. The Journal of experimental medicine. 207, 417-427 (2010).
- Nimmerjahn, F., Ravetch, J. Fcgamma receptors as regulators of immune responses. Nature reviews. Immunology. 8 (1), 34-47 (2008).
- Callen, E., et al. 53BP1 mediates productive and mutagenic DNA repair through distinct phosphoprotein interactions. Cell. 153 (6), 153-1280 (2013).
- Wesemann, D. R., et al. Reprogramming IgH isotype-switched B cells to functional-grade induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13745-13750 (2012).
- Wesemann, D., et al. Immature B cells preferentially switch to IgE with increased direct Sµ to Sε recombination. The Journal of experimental medicine. 208 (13), 2733-2746 (2011).
- Zarrin, A. A., et al. An evolutionarily conserved target motif for immunoglobulin class-switch recombination. Nature immunology. 5, 1275-1281 (2004).
- Fan, G., et al. Development of a class-specific polyclonal antibody-based indirect competitive ELISA for detecting fluoroquinolone residues in milk. Journal of Zhejiang University. Science. B. 13 (7), 545-554 (2012).
- Perez, O., Krutzik, P., Nolan, G. Flow cytometric analysis of kinase signaling cascades. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 263, 67-94 (2004).
- Jamur, M., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 588, 55-61 (2010).
- Ishizaka, T., Ishizaka, K. Mechanisms of passive sensitization. IV. Dissociation of IgE molecules from basophil receptors at acid pH. Journal of immunology (Baltimore, MD. : 1950). 112 (3), 1078-1084 (1950).
- Erazo, A., et al. Unique Maturation Program of the IgE Response In Vivo. Immunity. 26, 191-203 (2007).
- Xiong, H., Dolpady, J., Wabl, M., Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. Sequential class switching is required for the generation of high affinity IgE antibodies. Journal of Experimental Medicine. 209, 353-364 (2012).
- Yang, Z., Sullivan, B., Allen, C. Fluorescent in vivo detection reveals that IgE(+) B cells are restrained by an intrinsic cell fate predisposition. Immunity. 36 (5), 857-872 (2012).
- Berkowska, M. A., et al. Human IgE(+) B cells are derived from T cell-dependent and T cell-independent pathways. The Journal of allergy and clinical immunology. , (2014).
- He, J. -. S., et al. The distinctive germinal center phase of IgE+ B lymphocytes limits their contribution to the classical memory response. The Journal of experimental medicine. 210 (12), 2755-2771 (2013).
- Keegan, A., Fratazzi, C., Shopes, B., Baird, B., Conrad, D. Characterization of new rat anti-mouse IgE monoclonals and their use along with chimeric IgE to further define the site that interacts with Fc epsilon RII and Fc epsilon RI. Molecular immunology. 28 (10), 1149-1154 (1991).
