末梢血からのヒトアロ抗原特異的T細胞の生成
Summary
This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.
Abstract
The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.
Introduction
Tリンパ球は、適応免疫系の重要な構成要素である。 T細胞だけでなく、直接のエフェクター機構の様々を通して病原体に対する防御免疫応答を媒介するだけでなく、積極的な免疫学的自己寛容を維持し、免疫系の他の細胞の応答を指示するための責任がある。これらの機能は、T細胞受容体（TCR）ライゲーション、サイトカインおよびケモカインを含む統合された信号の数、および代謝産物1を介して導かれる。これらの信号のうち、TCRは、適応免疫におけるT細胞の役割を定義する特徴的な特異性を提供するので、特に重要である。 TCRは、T細胞エフェクター機能を開始する信号を提供するために、高度に特異的かつ高感度な方法でMHC（ヒトオルソログHLA）分子（pMHC複合体）によって提示された線状ペプチド抗原と相互作用する。 pMHC複合リガンドとTCRとの相互作用の生化学的パラメータだけでなく、Tに対する特異性を提供する細胞の活性化だけでなく、その後のT細胞機能2に定性的な影響を与える。したがって、T細胞の機能を研究することは、多くの場合に定義された抗原特異性を有するクローン性T細胞の応答を調べることが必要である。
約10 12αβT細胞を含むヒトT細胞区画、推定された10 7個含まれている- 10 8の異なるαβTCRs3-4。この多様なレパートリーは、防御免疫のためのT細胞応答を必要とするであろう潜在的な病原体からのペプチドの広大な配列を認識するための機会を提供する。その抗原5の前に免疫応答の非存在下で10 -7 -それは、自己MHCにより提示される特定の外来抗原に応答するT細胞の頻度は、10 -4のオーダーであると推定される。ナイーブT細胞レパートリーは、ペプチド抗原および制限が反応提示自己MHCを認識する能力を確保するために、胸腺選択することによって成形される自己ペプチド抗原に対するivity、防御免疫2を仲介するための潜在的な有用性を最大化する。しかし、この設計された反応性は、比較的大きな周波数に違反して、10 -3 -免疫学的にナイーブな個体由来のT細胞の10 -4は 、外来MHC分子だけでなく、それらが提示する内因性ペプチドの両方を認識し、同種異系の細胞による刺激に応答する6。同種異系のpMHCリガンドの認識は、自己MHCによって提示された外来抗原の認識と構造的に類似している。 TCRは同種異系MHC分子だけでなく、提示されたペプチド7の両方で重要な生化学的相互作用を行う。同種細胞8の表面上に存在するpMHC複合体の多様性から、同種刺激の結果に対するT細胞の応答の強固な性質。これは、各MHC 9、約2×10 4個の異なる内因性のペプチド抗原を提示すると推定される。このB同種刺激に対する応答のreadthは、T細胞の同種反応性に起因する、そのような宿主病（GVHD）に対する同種移植片拒絶または移植片として臨床的に関連する病理の重要な側面である。
ヒトT細胞のアロ反応性応答の研究は、伝統的に同種異系細胞での刺激の後に、ナイーブT細胞のポリクローナル応答を調べることに頼っている。限界希釈と組み合わされ、同じ同種異系の細胞株での反復刺激は同種異系HLA 10の定義された認識にクローン性T細胞を生成することができる分析。しかしながら、このアプローチは、HLAがT細胞の広範なレパートリーを刺激する特定の同種のために存在する内因性pMHC複合体の大規模で多様なレパートリーとして、個々の同種のpMHCリガンドへの応答を調べるための問題である。このバルク集団の刺激および限界希釈手法が望まをReactiでT細胞を単離するために多数のクローンのスクリーニングを必要とするシングルのpMHCリガンドに対するVITY。さらに、個々の同種のpMHCリガンドに応答するT細胞の頻度は、所与の抗原に応答したヒトT細胞クローンの効率的な生成に対する障壁を提示ナイーブT細胞集団の中でも比較的低い。
ポリクローナル集団からの抗原特異的T細胞の同定および単離は、フルオロフォアで標識されたpMHC複合多量体11の開発によって使用可能になっている。このアプローチは、ストレプトアビジン標識フルオロフォアに結合することによって標識される組換え可溶性ビオチン化MHC分子にロードされ、特定のペプチド抗原を利用する。のpMHCの多量体は、可溶性のpMHCリガンドのTCRの本質的に低い（μm）との親和性を補償、アビディティーを増加させる。標識細胞は、フローサイトメトリーによって同定し、単離することができる。しかしながら、このアプローチは依然として典型的にナイーブT細胞集団の中の抗原特異的T細胞の低頻度によって制限されほとんどのフローサイトメーター上で正確な同定と定量限界未満の桁違い。この制限に対処するために、四量体標識された細胞についてのpMHC四量体標識およびその後の磁気ビーズの濃縮方法は、12を開発してきた。この方法は、信頼できる検出、計数、および低周波の抗原特異的T細胞の単離を実証した。
このプロトコルは、具体的には、個々の同種異系のpMHCリガンドに反応するヒトT細胞クローンを生成するための効果的なプロトコルについて説明します。このプロトコルは、細胞をフローサイトメトリー選別および単ソートされた細胞（からのT細胞クローンの産生を可能にするために、ヒトT細胞のin vitro培養のための堅牢な方法ではアロ抗原特異的ヒトT細胞の単離のためのpMHC（HLA）多量体標識および濃縮を適用する図1の概要）。
Protocol
Representative Results
Discussion
T cell alloreactivity is a long-studied and clinically-relevant phenomenon. The robust proliferative and effector responses of T cells to allogeneic stimulation has enabled extensive analyses of human T cell responses in vitro through relatively straightforward mixed lymphocyte reactions of peripheral blood T cells against inactivated allogeneic cells. However, these primary alloreactive T cell responses are oligoclonal, comprised of a large number of individual T cells responding to specific alloantigens. This …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The author would like to thank the NIH Tetramer Core Facility for tetramer production. The author would also like to thank E.D. O’Connor and K.E. Marquez at the UCSD Human Embryonic Stem Cell Core Facility flow cytometry laboratory for assistance in cell sorting. This work was funded by National Institutes of Health grant K08AI085039 (G.P.M.).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Sodium heparin venous blood collection tube 16 x 100 mm | Becton, Dickenson and Company | 366480 | |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 7801 | |
| Rosette Sep Human T Cell Enrichment Kit | Stemcell Technologies | 15061 | |
| Dulbecco's PBS, 1x without Ca or Mg | Corning | 21-031-CV | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6635 | |
| Fluorophore-labeled pMHC tetramer | NIH Tetramer Facility | NA | |
| EasySep Biotin Selection Kit | Stemcell Technologies | 18553 | |
| EasySep Selection magnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
| TruStain FcX Human Fc blocking solution | Biolegend | 422301 | |
| Anti-CD5 PE-Cy7 (clone UCHT2) | Biolegend | 300621 | |
| Anti-CD14 FITC (clone HCD14) | Biolegend | 325603 | |
| Anti-CD19 FITC (clone HIB19) | Biolegend | 302205 | |
| Iscove's DMEM, without b-ME or L-glutamine | Corning | 15-016-CV | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| b-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Gentamicin sulfate (50 mg/ml) | Omega Scientific | GT-50 | |
| Human AB serum, male donor | Omega Scientific | HS-30 | |
| Recombinant human IL-2 | Peprotech | AF 200-02 | |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Life Technologies | 11131D | |
| Media | |||
| Cell sorting buffer | |||
| PBS, pH 7.4 | 1 L | ||
| BSA | 10g | ||
| EDTA (0.5 M) | 2 ml | ||
| Human T Cell Culture Medium | |||
| Iscove's DMEM | 351.6 ml | ||
| Heat-inactivated human AB serum | 40 ml | ||
| HEPES (1 M) | 4 ml | ||
| Glutamax (100 x) | 4 ml | ||
| Gentamicin (50 mg/ml) | 0.4 ml | ||
| b-mercaptoethanol (14.3 M) | 1.4 ml | ||
| Recombinant human IL-2 (1 mg/ml) | 1 ml |
Referências
- Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. S. T cell activation. Annu. Rev. Immunol. 27 (1), 591-619 (2009).
- Morris, G. P., Allen, P. M. How the TCR balances sensitivity and specificity for the recognition of self and pathogens. Nat. Immunol. 13 (2), 121-128 (2012).
- Arstilla, T. P., et al. A direct estimation of the human αβ T cell receptor diversity. Science. 286 (5441), 958-961 (1999).
- Robbins, H. S., et al. Comprehensive assessment of T-cell receptor β-chain diversity in αβ T cells. Blood. 114 (19), 4099-4107 (2009).
- Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K. W., Hasan, M., Albert, M. L. Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies. Blood. 115 (18), 3718-3725 (2010).
- Suchin, E. J., et al. Quantifying the frequency of alloreactive T cells in vivo: new answers to an old question. J. Immunol. 166 (2), 973-981 (2001).
- Felix, N. J., Allen, P. M. Specificity of T-cell alloreactivity. Nat. Rev. Immunol. 7 (12), 942-953 (2007).
- Morris, G. P., Ni, P. P., Allen, P. M. Alloreactivity is limited by the endogenous peptide repertoire. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (9), 3695-3700 (2011).
- Suri, A., et al. In APCs, the autologous peptides selected by the diabetogenic I-Ag7 molecule are unique and determined by the amino acid changes in the P9 pocket. J. Immunol. 168 (3), 1235-1243 (2002).
- Yssl, H., Spits, H. Generation and maintenance of cloned human T cell lines. Curr. Protoc. Immunol. 7, (2002).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Moon, J. J., et al. Naive CD4+ T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27 (2), 203-213 (2007).
- Chicz, R. M., et al. Specificity and promiscuity among naturally processed peptides bound to HLA-DR alleles. J. Exp. Med. 178 (1), 27-47 (1993).
- Ni, P. P., Allen, P. M., Morris, G. P. The ability to rearrange dual TCRs enhances positive selection, leading to increased allo- and autoreactive T cell repertoires. J. Immunol. In press, (2014).
- Morris, G. P., Uy, G. L., Donermeyer, D., DiPersio, J. F., Allen, P. M. Dual receptor T cells mediate pathologic alloreactivity in patients with acute graft-versus-host disease. Sci. Transl. Med. 5 (188), (2013).
- Altman, J. D., Reay, P. A., Davis, M. M. Formation of functional peptide complexes of class II major histocompatibility complex proteins from subunits produced in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (21), 10330-10334 (1993).
- Sabatino, J. J., Huang, J., Zhu, C., Evavold, B. D. High prevalence of low affinity peptide-MHC II tetramer-negative effectors during polyclonal CD4+ T cell responses. J. Exp. Med. 208 (1), 81-90 (2011).
