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Neurociência

Imagerie intravitale de axonales Interactions avec microglie et les macrophages de souris dans une colonne dorsale Crush blessures

Published: November 23, 2014
doi:
10.3791/52228
, , ,
1Department of Neurosciences,Case Western Reserve University, 2Department of Biomedical Engineering,Case Western Reserve University, 3Department of Pediatrics,Case Western Reserve University

Summary

Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury.

Abstract

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. Intra-vital two-photon microscopy enables the study of macrophages and microglia in the spinal cord lesion in the living animal. This can be performed in adult animals with a traumatic injury to the dorsal column. Here, we describe methods for distinguishing macrophages from microglia in the CNS using an irradiation bone marrow chimera to obtain animals in which only macrophages or microglia are labeled with a genetically encoded green fluorescent protein. We also describe a injury model that crushes the dorsal column of the spinal cord, thereby producing a simple, easily accessible, rectangular lesion that is easily visualized in an animal through a laminectomy. Furthermore, we will outline procedures to sequentially image the animals at the anatomical site of injury for the study of cellular interactions during the first few days to weeks after injury.

Introduction

La réaction inflammatoire à la maladie ou de blessures du système nerveux central (SNC) est mal compris, en particulier en ce qui concerne les interactions entre les cellules immunitaires et résidentes sur le tissu. Investigations de ces interactions cellulaires de la moelle épinière sont d'un intérêt particulier dans l'animal vivant. La seule facilement accessible CNS matière blanche voies est dans les colonnes dorsales de la moelle épinière, ce qui en fait un domaine important sur lequel concentrer les efforts sur l'amélioration de l'approche expérimentale possible. Ces recherches ont été limitées en raison de la difficulté technique à accéder et à stabiliser le système nerveux central pour l'imagerie. Imagerie en temps réel dans la moelle épinière a été décrit précédemment 1-13 mouvement cellulaire, cependant, peu d'études ont abordé dans une blessure de la moelle épinière au-delà de quelques heures après l'agression initiale. La lésion traumatique de la moelle épinière est un milieu complexe, avec des neurones, des astrocytes, des fibroblastes, des cellules progénitrices, des cellules et NG2 immunitaires including microglie, les neutrophiles, les macrophages, les cellules T, les cellules B et les cellules dendritiques 14,15. Les macrophages sont le sous-ensemble de cellules immunitaires responsables de la phagocytose dans la lésion, infiltration de la circulation. Le rôle de ces cellules phagocytaires a été débattu, avec des rapports indiquant que ces cellules peuvent prendre sur les deux rôles dommageables et de protection dans le tissu blessé. Ces rôles vont de plus en plus le dépérissement des axones après une lésion secondaire et agissant de manière phagocytaire 16 à 22, pour prendre sur un phénotype cicatrisation et la diminution des déficits fonctionnels chez l'animal blessé 21,23,24.

Auparavant, les tentatives de distinguer les macrophages de la microglie fondées principalement sur la morphologie dans le tissu sain. Cependant, la microglie et des macrophages activés expriment un grand nombre des mêmes marqueurs et afficher morphologie indiscernable après une lésion de 25 à 29, ce qui rend la séparation des différentes activités de ces cellules difficiles à étudier based sur ces facteurs seuls 30. Ces cellules peuvent être séparées par une expression différentielle de CD45 en utilisant la cytométrie de flux 33,34, bien que cette approche est moins utile pour discriminer ces types cellulaires in vivo. Utilisant expression différentielle de CCR2 et CX3CR1 dans la microglie et les macrophages a également été explorée, bien que les changements dynamiques dans l'expression de ces marqueurs que les monocytes se différencient en macrophages peuvent compliquer l'analyse précise 35,36. Microglies sont les cellules immunitaires résidentes dans le SNC et se pose à partir de progéniteurs vitelline cours du développement fœtal, tandis que les macrophages sont dérivées de progéniteurs de moelle osseuse et pénètrent dans le SNC blessé après une insulte 31,32. Une approche alternative à l'utilisation morphologie de distinguer ces deux types de cellules est de remplacer la moelle osseuse avec progéniteurs d'un animal donneur exprimant un marqueur traçable dans les macrophages dérivés des progéniteurs des donateurs, tout en préservant le résident CNS, recipient dérivé microglie. Ces modèles chimères de moelle osseuse sont couramment utilisés dans de nombreuses autres applications 37-40. Cette méthode présente réserves uniques de dommages sur l'intégrité de la barrière hémato-encéphalique provoquée par irradiation ou cytotoxiques médicaments utilisés pour éliminer les progéniteurs de moelle chez l'hôte, ce qui limite son utilisation dans certaines applications. Récemment, distinctions fonctionnelles entre la microglie et les macrophages dans le SNC commencent à être discerné en utilisant la cytométrie de flux, l'analyse du tableau des puces à ADN et les méthodes de chimérisme 24,26,41-44, qui se révélera très utile à l'avenir. Bien que la séparation de ces deux types de cellules reste difficile, la compréhension de leurs fonctions uniques est important pour mener à des traitements plus ciblés de troubles qui impliquent à la fois la microglie et les macrophages au sein du CNS.

Description des interactions cellulaires au sein de la lésion de la moelle épinière a principalement proviennent d'études portant sur des modèles de culture cellulaire. Il se agit due les défis liés à l'imagerie à la fois la lésion de la moelle épinière et les cellules immunitaires ensemble dans un animal vivant. Des modèles de rongeurs actuels de blessures de la moelle épinière de varier le type et la gravité incluent des modèles de contusion 45,46, les blessures de piqûre d'épingle, deux lacération 47, et le préjudice colonne dorsale écrasement décrit ici 16,18,48. L'inflammation des méninges augmente avec la gravité des blessures et pose des défis uniques pour l'implantation des fenêtres ou des interventions chirurgicales pour l'imagerie de série. Certains de ces problèmes incluent l'infiltration de cellules phagocytaires ainsi que la production de tissus fibreux sur le site chirurgical. Certains de ces problèmes peuvent être surmontés par la création de petites lésions et couvrant la moelle épinière exposée avec pansement chirurgical non immunogène entre la dure-mère et les muscles paraspinous pour permettre la chirurgie réouverture ultérieure, comme on le fait ici pour étudier la colonne lésion par écrasement dorsale . La capacité de l'image que la partie dorsale du spinal cordon limite également le choix de blessure, puisque les modèles de contusion causent principalement d'endommager le cordon central, épargnant souvent la partie la plus dorsale des colonnes dorsales, en particulier aux points de temps précoces après une blessure 45,49. Par conséquent, nous décrivons un modèle de lésion simple qui donne une répétable, lésion de forme propre, rectangulaire qui est utile à la fois pour l'observation du mouvement de cellule à l'intérieur de la lésion et de quantification facile de axonal position par rapport à la lésion.

Protocol

REMARQUE: Tous les animaux doivent être logés et utilisés conformément à la garde d'animaux et l'utilisation comité (IACUC) dans l'établissement. Toutes les procédures décrites ici sont approuvés par la Case Western Reserve University IACUC. 1. animaux transgéniques Utilisez la souris rapporteurs fluorescents disponibles dans le commerce pour étiqueter axones (Thy-1 YFP H) 50 et la microglie / monocytes (CX3CR1 GFP / GFP 51; voir la liste des matériaux). Ces souris devraient être intercroisés et entretenus comme des colonies individuelles de reproduction conformément aux politiques de protection des animaux. 2. Les chimères de moelle osseuse Identifier les animaux qui sont au moins 8 semaines d'âge à utiliser comme animaux receveurs. Placez animaux hôtes dans une irradiation tenant cage circulaire conçu pour tenir la souris dans une position pour assurer une irradiation du corps entier. Réglez la minuterie sur une césium (Cs-137) irradiateur pour administrer un dos de rayonnement du corps entierâge de 800-1000 Rads aux animaux selon les instructions du fabricant (exemples indiqués ici sont 980 rads). Retour animaux dans leurs cages pour se reposer pendant un minimum de 4 heures. Choisir animaux donneurs du génotype approprié (voir la figure 2A) comme source de cellules progénitrices de moelle osseuse. NOTE: Les bailleurs de fonds appropriés sont des animaux exprimant différents journalistes fluorescentes spécifiques à la lignée de l'hôte pour identifier les différentes populations de cellules, ou l'un des même génotype que les contrôles. Remplissez une boîte de Pétri avec 70% d'alcool, et un deuxième plat avec 10 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) médias et une passoire 40 um cellulaire trempé dans les médias. Remplir un tube conique de 15 ml avec un milieu RPMI. Gardez les plats et le tube sur la glace. Sacrifier les animaux donneurs par asphyxie au CO2 selon les directives institutionnelles. Nettoyer la peau et de la fourrure en trempant l'animal entier avec 70% d'éthanol jusqu'à ce que toute la fourrure est mouillé. Retirez le skà partir de la moitié inférieure de l'animal en coupant autour de la section médiane et en tirant la peau vers le bas sur les pattes arrière pour exposer complètement les muscles de la jambe. Retirer le tibia par surextension antérieure à l'articulation du genou à disloquer l'os, puis à l'aide de pinces et ciseaux stériles, peler et couper les muscles loin de deux extrémités du tibia. Placez l'os dans la boîte de Pétri avec de l'alcool pour un maximum de 30 secondes puis transfert à la crépine de cellule à l'intérieur de la boîte de Pétri contenant les médias. Disloquer la hanche et de décoller les muscles attachés au fémur, placé brièvement fémur dans l'alcool et puis placez-le dans le même filtre cellulaire à l'intérieur du plat. Dans une hotte culture tissulaire, utiliser des ciseaux stériles pour couper les deux extrémités des os et insérer une aiguille de calibre 21 sur une seringue de 1 ml dans l'extrémité de l'os. Rincer la moelle dans la conique de 15 ml avec les médias. Répéter les procédures pour les os restants. Utilisation de l'arrière du piston d'une seringue de 3 ml, écraser os se termine dans la cellulecrépine sur la boîte de Pétri pour extraire plus de cellules. Placez le filtre sur le dessus d'un tube conique de 50 ml et transférer du contenu multimédia avec des cellules aspiré du tube de 15 ml conique. Utiliser l'arrière du piston pour écraser la moelle de manière à obtenir une suspension cellulaire unique. Laver les 15 ml du tube conique, des fragments d'os et le tamis cellulaire avec 30 ml de milieu dans un tube conique de 50 ml. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 500 x g pour sédimenter les cellules. Lyser les globules rouges avec 2 ml de chlorure d'ammonium-potassium-réception (ACK) tampon de lyse pendant 2 min. Stopper le tampon de lyse avec 10 ml de milieu contenant 10% de sérum bovin foetal. Centrifuger à 500 g pendant 5 à 10 min pour sédimenter. Laver les cellules une fois dans 10 ml de milieu RPMI et deux fois dans une solution saline, une centrifugation à 500 xg pendant 5 à 10 min pour former un culot à chaque lavage. Remettre en suspension les cellules à une concentration finale de 3 x 10 6 cellules dans 200 ul de solution saline. Transfert 3 x 10 6 cellules de la moelle par injection veine de la queue dans irrsouris receveuses adiated. Placez l'eau acidifiée (pH 3,0) dans une cage de destinataire et permettent souris pour récupérer. REMARQUE: Les souris qui ne parviennent pas à la transplantation va mourir dans les 10-14 jours après la procédure. Après 8 semaines, reconstitution de moelle vérifier en examinant les cellules immunitaires du sang périphérique à l'aide de la cytométrie de flux (Figure 2B-C). 3. Dorsale Colonne Crush blessures REMARQUE: Choisissez animaux chimères appropriées ou des animaux transgéniques doubles pour la chirurgie sur la base de l'expérience souhaitée. Animaux avec des cellules de moelle provenant de résidents ou d'os soit marquées ont été créés dans les étapes précédentes. Préparer et autoclave outils chirurgicaux, y compris les rongeurs, Dumont # 4 pinces, ciseaux, pince iris pour les tissus, les pilotes titulaires de seringues et des agrafes. Préparer médicaments à administrer aux souris pour contrôler la douleur. Bupernex et Marcaine sont couramment utilisés pour le contrôle de la douleur. Utilisez les médicaments appropriés comme l'exige unee approuvé par le Comité des soins et de l'utilisation des animaux institutionnel (IACUC). Induire une anesthésie avec 4% d'isoflurane et de maintenir avec 1-2% d'isoflurane à atteindre un taux de 60 à 100 respirations par minute respiratoire. Appliquer du lubrifiant des yeux aux yeux de l'animal pour prévenir la sécheresse sous anesthésie et de confirmer l'absence de réponse à pied pincée. Maintenir la température à l'aide d'un coussin chauffant et surveiller la température en utilisant une sonde rectale. Raser le dos de la souris avec un rasoir électrique par rapport au niveau de la moelle épinière ciblée, puis nettoyer la zone trois fois avec de la povidone-iode, suivie par deux fois avec 70% d'alcool. Placez l'animal sur un champ stérile, et couvrir l'animal avec un autre champ stérile avec un trou découpé dans un endroit approprié pour visualiser le site chirurgical. Maintenir tous les outils sur des champs stériles tout au long de la chirurgie. Couper la peau le long de la ligne médiane au niveau spinal souhaité avec iris ciseaux pour exposer le muscle du dos de l'animal. En vertu d'un dissète microscope, couper les muscles du dos, y compris le trapèze et les ligaments du grand dorsal le long de la ligne médiane où ils se fixent aux apophyses épineuses dorsales, et d'exposer la colonne vertébrale. Retirer les muscles rotateurs entre les apophyses des vertèbres dorsales et transversale de la vertèbre pour révéler la lame de la vertèbre spécifique à enlever (T11 dans ce cas). Identifier T11 par l'insertion de la dernière côte flottante non sur ce processus. Insérez conseils de rongeurs dans l'espace ci-dessus et ci-dessous le processus doit être enlevé et soulever légèrement pour se assurer qu'ils sont bien en place autour de la lame vertébrale mais pas trop profonde pour blesser la colonne vertébrale. Fermer rongeurs dans un mouvement à supprimer la lame. Agrandir la laminectomie au besoin en utilisant les rongeurs pour éliminer les petites parties de la vertèbre restante. Mesurer 1 mm des pointes d'une pince # 4 en les tenant contre une règle et le marquage avec un marqueur permanent. Mesurer un 1 mm de séparation pariween les deux dents en maintenant la pince contre la règle et fixer la largeur maximale des conseils à 1 mm en glissant un anneau de forceps en caoutchouc en place sur l'arbre de la pince. Créer un petit trou en insérant une aiguille de calibre 30 à travers la dure-mère sur les deux points d'insertion pour les dents de la pince pour accéder à la moelle épinière. Insérez les dents forceps à un angle de 90 ° par rapport à la dure-mère à travers les trous à la profondeur de 1 mm marqués sur les côtés de la pince, se assurer que la marque est au dessus de la dure-mère. Pincez fermer la pince et maintenez pendant 10 sec. Libération et répétées pince presser deux fois de plus pour un total de trois cales. Retirer la pince de la moelle épinière. Tremper un morceau de gélatine absorbable comprimé éponge dans une solution saline et la placer sur le site de blessure. L'utilisation d'un point courant, suturer le muscle en place au cours de la laminectomie et trempés éponge de gélatine avec # 4 synthétiques fils de nylon non résorbables. Clip de la peau en place en utilisant 5 mm blessure clips. Injecter 10 ul Marcaine (1,0 mg / kg) dans 490 ul de solution saline sous-cutanée autour du site d'incision et 5 pi Bupernex (0,1 mg / kg) par voie intramusculaire dans les muscles fessiers. Laisser animal à récupérer sur un coussin chaud et surveiller de difficultés de circulation ou des signes de paralysie dans les membres postérieurs. Ne pas laisser l'animal sans surveillance ou en présence d'autres animaux jusqu'à guérison complète de l'anesthésie. Ne utilisez pas les animaux qui affichent des déficits moteurs observables. REMARQUE: Bien que cette lésion d'écrasement peut être effectuée à ne importe quel niveau le long de la moelle épinière, pratiquement, T10-L4 pose moins de difficultés techniques pour l'imagerie par rapport à la respiration et à stabiliser les mouvements du corps à l'aide des pinces. de pince de placement doit être modifiée autour de la cage thoracique à l'image au niveau du thorax. 4. Imagerie intravitale Préparer et autoclave outils chirurgicaux, y compris Dumont # 4 pinces, ciseaux, pince iris pour maintenir le tissu, l'aiguille ddes rivières et des clips enroulés. Anesthésier la souris comme avant avec l'isoflurane. Induire une anesthésie à 4-5% et de maintenir à 1-2% comme nécessaire pour maintenir un taux de souffle de 60 à 100 respirations par minute et une absence de réponse aux pieds pincée. Gardez la souris chauffée, surveiller le rythme de la respiration lorsqu'il ne est pas l'imagerie et de surveiller en continu la température de l'animal avec une sonde rectale. Nettoyer la peau autour des clips de la plaie avec de la bétadine et puis l'alcool et retirer les clips de la plaie selon les instructions du fabricant. Une fois clips plaies sont supprimés, enlever les poils avec Nair si nécessaire et nettoyer le site à nouveau avec de l'alcool de povidone-iode et 70%. Re-ouvrir la peau avec des ciseaux. Retirez les sutures restants du muscle et tirez musculaire dehors avec une pince, coupe avec des ciseaux si nécessaire. Sous un microscope de dissection, pour créer des poches de serrage de la moelle épinière en coupant le muscle avec des ciseaux sur le côté de l'apophyse transverse au niveau de la vertèbre vertébral une au-dessus et en dessous du laminectomy. Placez pinces autour de chacun de ces vertèbre et serrer. Ajuster au besoin pour laisser place à objectif de microscope pour atteindre la moelle épinière. Se assurer que la moelle épinière est parallèle à la plate-forme d'imagerie, et à maintenir la stabilité des tissus pour l'imagerie. Si la respiration artefact est vu, pinces réajuster en conséquence pour minimiser le mouvement dans le domaine de l'imagerie. Couvrir les pinces avec parafilm. Retirer la gélatine comprimé éponge absorbable de la moelle épinière avec une pince, ramasser délicatement descendre autant de pièces que possible, aussi autant enlever du tissu cicatriciel de plus les méninges que possible. Couverture exposé la moelle épinière avec une solution saline et nouvelle éponge si nécessaire. NOTE: Si un saignement du muscle environnant, soit ardent avec une éponge ou cautériser au besoin. Cependant, prendre soin de ne pas toucher la moelle épinière à la cautérisation. Couvrir la moelle épinière soit avec un morceau de tissu humide ou de la gélatine comprimé éponge quand cautériser. Créez un well pour maintenir le fluide d'immersion par le premier élément d'étanchéité avec la peau et du tissu Vetbond, puis en utilisant l'acrylique dentaire pour construire un puits entre les deux brides du support de la moelle épinière et les côtés de l'animal. Attendez jusqu'à ce que les cures acryliques. Remplir le puits avec du liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF) et vérifier de nouveau pour tout saignement autour du site de la chirurgie. En option à ce stade, d'injecter des colorants fluorescents navire par voie intraveineuse par injection dans la veine de la queue de mettre en évidence des vaisseaux sanguins pendant l'imagerie. REMARQUE: le dextrane fluorescent au-dessus de 70 kDa est souvent utilisée, bien que des points quantiques et les lectines marquées par fluorescence des colorants servent également en tant que navire utiles. 50 ul de 150 000 WM TRITC-dextrane est typiquement injectés par voie intraveineuse. Pour obtenir la motilité immunitaire physiologiquement pertinente de la cellule, la température de la souris doit être maintenue à 37 ° C. Déplacez la souris à un environnement à température contrôlée sous le microscope pour l'imagerie et de surveiller l'animal pour anes correctsniveau de sie par le taux de respiration et pieds pincée. Surveiller l'animal fréquemment lors de l'imagerie pour déterminer la profondeur de l'anesthésie, visant à atteindre une fréquence respiratoire de 60 à 100 respirations par minute. Localiser le site d'imagerie à travers l'oculaire du microscope. Réglez le 2 photons microscope à balayage laser de prendre une image z-pile tous les 30 à 60 secondes pour obtenir des données dynamiques d'imagerie. Une fois la session d'imagerie est terminée enlever l'animal de la zone chauffée. Desserrer les colliers de la colonne vertébrale et retirez la souris des pinces. Tirez acrylique bien loin de la peau tout en enlevant les pinces. Si la souris est à nouveau analysé par imagerie, placer une solution saline imbibé gélatine comprimé éponge sur la moelle épinière. Fermez le muscle et la peau sur le site de la chirurgie. Ne pas laisser l'animal sans surveillance ou en présence d'autres animaux tout en récupérant de l'anesthésie. Si l'animal montre des signes de déficit neurologique après la récupération, l'animal devrait être euthanasié. Sinon, euthanasierla souris dans une chambre de CO 2 avant qu'il ne émerge de l'anesthésie selon le protocole de l'euthanasie IACUC approuvé. Analyser images fluorescentes en utilisant un logiciel d'analyse d'images en suivant les instructions du fabricant.

Representative Results

Un diagramme schématique représentant la lésion dorsale colonne écrasement est représenté sur la figure 1A. Après la lésion, l'animal est préparé et stabilisé par microscopie intravitale utilisant des brides de la colonne vertébrale (figure 1B). Une image prise immédiatement après la blessure dorsale colonne écrasement montre une lésion rectangulaire clairement visible avec des points d'insertion des pinces à dents qui sont clairement identifiables. Axones au site de la lésion sont coupés sur toute la durée de la colonne dorsale ensemble (figure 1C). L'intégrité des vaisseaux sanguins reste intact, et aucun signe de fuite de colorant de cuve a été détecté par fluorescence. Pour effectuer l'imagerie de série de la même lésion au fil des semaines, les muscles et la peau peuvent être suturés sur la laminectomie de ré-exposition ultérieure. Lésion similaires morphologie est considérée à des moments plus tard (figures 1D, E). 5 jours après la blessure, les sites pince d'insertion sont encore visibles, mais la lésion a commencé à augmenter en taille due d'une blessure causée par une inflammation secondaire. Les axones à l'extrémité caudale de la lésion ont rétractée à partir du site de la lésion initiale par un processus appelé "dépérissement des axones". Les axones à la fin rostrale de la lésion présentaient une dégénérescence wallérienne-like (figure 1D, E). Entre 5 et 22 jours après la blessure, la taille de la lésion est stabilisée. En même temps, un afflux important de cellules CX3CR1 + peut être vu infiltrant dans et autour de la lésion par écrasement au cours de ces points dans le temps, bien que l'identité de ces cellules microgliales (macrophages) par rapport à ne peut être distingué lors de la préparation comme indiqué à la figure 1. Afin de distinguer le comportement de la microglie et les macrophages dans le béguin lésion microenvironnement, un modèle chimère de rayonnement a été utilisé (décrit dans la figure 2A). Tout d'abord, les cellules progénitrices de la moelle osseuse d'un + / GFP CX3CR1 souris sont remplacés par des cel donneur non fluorescentls, ainsi que la microglie + SNC-résident GFP sont visibles par imagerie de fluorescence. L'efficacité de reconstitution de moelle peut être confirmée par cytométrie en flux examen du sang périphérique 8 semaines après la greffe de moelle (figure 2B, C). Dans la figure 2B, F4 / 80 et macrophages GFP-positives, surligné en bleu, sont détectés dans un CX3CR1 + / GFP → C57BL / 6 souris chimère, dans lequel certains monocytes positifs négatifs, mais F4 / 80 GFP sont également présents. Dans la figure 2C, ne F4 positive double / 80 et les cellules GFP-positives sont à gauche après le remplacement de CX3CR1 + / GFP os receveur osseuse de type sauvage de la moelle osseuse. Avant de blessures, les microglies sont répartis uniformément dans la moelle épinière, l'affichage d'un repos, la morphologie ramifiée (figure 2D). 8 jours après la lésion, à seulement quelques microglie peuvent être détectés dans et autour de la lésion. Ces microglies affichent une morphologie amiboïde (figure 2E). Deuxièmement, l'osdes cellules progénitrices de moelle chez une souris non fluorescent sont remplacées par des cellules de moelle d'un + / GFP souris CX3CR1, ce qui rend donc la moelle osseuse dérivée CX3CR1 + monocytes / macrophages visibles par fluorescence de la GFP (Figure 2A). Avant de blessure, la seule GFP + cellules détectées sont largement périvasculaire, qui ont été rapportés pour être dérivée de la moelle osseuse et retourner continuellement sur ​​une base régulière 28 (figure 2F). Après une lésion par écrasement, les cellules + / GFP CX3CR1 peuvent être vus le long de l'intérieur des vaisseaux sanguins entourant la lésion (Figure 2H-J), et le centre de la lésion est rempli d'infiltration des macrophages CX3CR1 + / GFP (figure 2G). Time lapse imagerie des colonnes dorsales peut être effectuée jusqu'à 6 h. Sur la figure 3, on montre un CX3CR1 non chimérique + / GFP souris immédiatement après la lésion dans laquelle les cellules de la circulation peuvent être voirn déplaçant sur ​​le vaisseau sanguin vers le coeur de la lésion et se déplaçant dans le site de la lésion (figure 3A, B; Supplemental Film 1). L'analyse d'image en utilisant l'intensité de fluorescence pour identifier les cellules peuvent suivre les chemins empruntés par les macrophages (figure 3A, B; supplémentaire Film 1). Les statistiques tirées de l'analyse d'imagerie montrent la motilité moyenne de macrophages dans la lésion est de 3,6 um / min (Figure 3D). Enfin, à 22 jours après la lésion, les axones, la microglie et les macrophages peuvent encore être détectés dans la lésion démontrant le domaine de l'imagerie est stable sur de longues périodes de temps (Movie complémentaire 2). Figure 1: Création et imagerie séquentielle de la blessure dorsale colonne d'écrasement. (A) Le dorsalblessures colonne d'écrasement est effectuée en enlevant le processus dorsale de la vertèbre au niveau d'intérêt. Les forceps sont insérés dans la colonne dorsale de la moelle épinière 1 mm et sont ensuite fermées trois fois pour produire la lésion en violet. (B) L'animal est ensuite positionné avec la moelle épinière des colliers pour obtenir une stabilité pour l'imagerie intravitale. (C) Immédiatement après l'accident, les forceps sites d'insertion (ovale rouge) et le (boîte grise) du volume de lésion par écrasement rectangulaire peuvent être clairement identifiés. Les axones dans les racines dorsales peut être vu (flèches blanches), ainsi que les extrémités blessés des axones du côté caudal de la lésion (têtes de flèches pleines). (D) 5 jours après la lésion, les pinces sites d'insertion (ovale rouge ), et la mesure de la (zone grise de la lésion) peut encore être visualisé facilement. La lésion a augmenté de taille depuis l'agression initiale. Axones subissant une dégénérescence wallérienne comme peuvent être vus à la lésion rostrale (têtes de flèche ouverte) dans additià axones dans les racines dorsales (flèches blanches) et les extrémités des axones lésés (têtes de flèches blanches). (E) 22 jours après la lésion, le site de la lésion est toujours identifiable avec des dimensions similaires à la lésion au bout de 5 jours. Notez le grand nombre de cellules CX3CR1 + dans et autour du site lésé. Caractéristiques marqués sont les mêmes que dans (D). Toutes les barres d'échelle = 200 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 2: Construction des souris chimériques pour suivre CX3CR1 + / macrophages exprimant la GFP dérivées de moelle résidentes du SNC microglie ou d'os dans la colonne dorsale lésion d'écrasement. (A) Un diagramme schématique de la production de souris chimériques avec soit CX3CR1 + / GFP exprimant microglia ou macrophages. En premier lieu, des souris Thy-1 H YFP sont irradiés et la moelle osseuse est reconstituée avec des cellules de moelle isolées à partir de a + / GFP CX3CR1 souris, ce qui entraîne une souris chimérique dont les macrophages sont GFP +. Deuxièmement, Thy-1 YFP souris H / CX3CR1 + / GFP sont irradiés et la moelle osseuse est reconstituée avec des cellules de moelle isolées à partir de souris non fluorescente, la production d'une souris chimère dont la microglie sont GFP +. (B) Exemple de cytométrie de flux de données avec des cellules F4 / 80 + et CX3CR1 GFP + dans le sang d'un animal chimérique avec un + / GFP donneur de moelle CX3CR1 transplanté dans une irradié C57BL / 6 destinataire. Cellules dérivées des donneurs positifs CX3CR1 qui sont positifs à la fois pour la GFP et F4 / 80 sont présentés dans le bleu zone surlignée. (C) Exemple de cytométrie de flux de données avec F4 / 80 + et CX3CR1 cellules GFP + dans un animal chimérique avec un C57BL6 moelle du donneur transplanté dans un irrayonnée CX3CR1 récipiendaire + / GFP. Notez l'absence de double positif CX3CR1 + / GFP et F4 / 80 cellules au sein de la zone surlignée en bleu. (D) Une intravitale deux photons cliché microscopique d'une souris du premier schéma chimérique, montrant GFP + microglie avec une morphologie ramifiée au sein de la dorsale colonne (tête de flèche). Ces cellules sont intercalées entre les axones (jaune) de la racine dorsale et la colonne dorsale. La barre d'échelle = 100 um. (E) imagerie intravitale de la même souris (B) 8 jours après la blessure de la colonne dorsale révèle quelques-uns CX3CR1 + microglie avec les organismes grandes et en forme amiboïdes cellulaires qui manquent processus (tête de flèche). Barre d'échelle = 100 um. (F) Snapshot d'une souris à partir de la deuxième schéma chimérique dans (A), montrant peu GFP + macrophages, dans le parenchyme CNS. Barre d'échelle = 100 um. (G) d'imagerie intravitale de la même souris dans (F) 8 jours après la lésion de la colonne dorsale al révèlearge afflux de macrophages dans et autour de la lésion. La barre d'échelle = 100 um. (H) Une photo de grossissement plus élevé de cellules dérivées de sang + CX3CR1 en contact avec les navires dans l'animal blessé. Barre d'échelle = 30 pm. (i) une reconstruction des cellules CX3CR1 en contact avec le récipient, vu de l'intérieur du récipient. Barre d'échelle = 30 pm. (J) Une reconstitution de cellules CX3CR1 en contact avec le récipient, vue de l'extérieur de la cuve. La barre d'échelle = 20 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 3 :. Données de suivi cellulaire représentatifs dans un CX3CR1 non chimérique + / GFP souris immédiatement après la colonne dorsale écrasementblessures. (A) Un instantané de CX3CR1 + microglie et les macrophages autour des axones endommagés (jaune) du film supplémentaire 1 immédiatement après une blessure colonne dorsale d'écrasement. (B) Les chemins (gris) prise par les CX3CR1 cellules + dans (A) au cours d'une 110 min session d'imagerie intravitale. (C) Un temps de représentation codée des pistes en (B). Les pistes sont colorés en fonction de leur temps à l'intérieur tout le film de 110 minutes, comme indiqué dans la barre de temps. (D) de l'histogramme de la motilité globale des cellules CX3CR1 +. Toutes les barres d'échelle sont de 30 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Film supplémentaire 1: film intravitale Représentant immédiatement après la blessure colonne dorsale à l'écrasement dans le double hétérozygote Thy-1 YFP / + <strong> / CX3CR1 GFP / + souris. imagerie intravitale moelle a été effectuée immédiatement après une colonne écrasement blessure dorsale au niveau T11. Panneau de droite montre le mouvement de CX3CR1 + microglie et les macrophages. Les chemins du mouvement cellulaire sont présentés comme des pistes blanches sur le panneau de gauche. La blessure se trouve dans le coin supérieur gauche. CX3CR1 + cellules peuvent être vus se déplaçant dans le site de la blessure le long de ces pistes. Les axones sont représentées en jaune. La barre d'échelle = 40 um. Temps total: 110 min. La vitesse de lecture: 300x. Film complémentaire 2:. Film intravitale Représentant à 22 jours après la colonne dorsale écrasement lésion dans la double hétérozygote Thy-1 YFP / + / CX3CR1 GFP / + souris Montré ici est un film représentatif pris dans une souris 22 jours après la première écrasement de la colonne dorsale blessures à la colonne vertébrale au niveau T11. Le injUry se trouve dans le coin supérieur droit du cadre. Axones (jaune) croissant rostralement sont présentés en bas à droite. Les veine dorsale et les vaisseaux sanguins sont étiquetés avec TRITC-dextrane (rouge). CX3CR1 + cellules dans le mouvement de la lésion à une vitesse plus lente par rapport à ceux immédiatement après la blessure. La barre d'échelle = 50 um. Temps total: 90 min. La vitesse de lecture: 600x.

Discussion

interactions de l'imagerie de différents types de cellules dans leurs compartiments de tissus indigènes pendant la pathologie qui a suivi en temps réel a suscité un grand intérêt. Dans le réseau dense de la CNS, contact cellule-cellule et de signalisation avec des cellules adjacentes sont essentiels pour le fonctionnement normal et pour comprendre la pathologie du système nerveux central. Ici, nous avons décrit l'utilisation de deux photons microscopie à balayage laser pour l'observation du mouvement cellulaire au sein d'une lésion mécanique de la moelle épinière. En plus de la qualité de la préparation de la chirurgie et le tissu, la stabilité mécanique du tissu est primordial pour le succès de microscopie time-lapse, en particulier l'isolement de la moelle épinière de respirer artefact de mouvement. La stabilité peut être appréciée par la recherche de mouvement de la moelle épinière sous un microscope à dissection qui correspond à la fréquence cardiaque ou la respiration de l'animal. La stabilité doit être évaluée à la fois pendant la chirurgie et également immédiatement avant le début de l'imagerie. Si l'animal ne est pas stable, des ajustements devraient être faits pour le placement et le serrage des colliers de la moelle épinière. modèles fluorescent spécifique journaliste souris de type cellulaire couplés avec des approches chimères de moelle osseuse ont permis l'identification de cellules monocytes par rapport à la microglie et des axones. Des études antérieures ont révélé que les monocytes dérivés du sang et non la microglie sont responsables des dommages axonale secondaire après un traumatisme en utilisant la méthodologie décrite ici 43. Dextran colorant conjugué navire permet l'identification du navire à la fois de fournir des points de repère et d'identifier les violations de l'intégrité de la cuve. La sélection du modèle de la souris reporter fluorescente appropriée est essentiel pour permettre l'identification correcte des types de cellules souhaitées à imager.

Développement de modèles de souris fluorescentes qui sont appropriés pour les études entreprises est également essentielle à la réussite des expériences. La distinction entre les deux populations phagocytaires de CX3CR1 + / GFP </sup> Cellules dans le SNC a toujours été difficile. Comme représenté ici, une technique immunologique commun, les chimères d'irradiation, peut être utilisée pour distinguer, la microglie CNS-résident de radio-résistant de macrophages dérivés de la moelle osseuse. La procédure d'irradiation a le potentiel d'endommager la barrière hémato-encéphalique et de modifier phénotypes cellulaires, donc l'utilisation de ce modèle doit être examinée attentivement. L'ampleur de ces changements diffère avec la dose d'irradiation ainsi que la durée de la période de récupération, et de leur impact sur les différents modèles inflammatoires n'a pas été entièrement étudiées. Les effets de l'irradiation sur le SNC barrière hémato-encéphalique peuvent être minimisés en protégeant la tête lors de l'irradiation, ce qui a été montré pour diminuer l'infiltration de cellules dans la moelle épinière après l'irradiation, même si la moelle épinière est pas directement blindé 52. Ici, nous avons observé que le nombre de cellules infiltrant dans le SNC à l'état d'équilibre en raison de la génération chimère est négligeable, contrairement à l'engourdissementer de pénétrer dans les cellules de la lésion. Autres modèles alternatifs à considérer comprennent chimères dus à la drogue ou 52 modèles de souris parabiose 53.

Ici, nous avons présenté un modèle de lésion petit spécifique, simple et reproductible, qui se traduit par une lésion de la matière blanche dorsale de la moelle épinière qui est facile à image en utilisant la microscopie 2 photons. Cette méthode fournit également une lésion quantifiable pour doser le degré de dépérissement axonale dans les colonnes dorsales que dans la littérature a été couplée à l'analyse complémentaire tissu fixé 16,18,43,48,54. Dans ce modèle, les animaux ne affichent que des déficits minimes et ne nécessitent aucun soin particulier après une blessure. Les futures études utilisant les techniques de blessures colonne d'écrasement et d'imagerie dorsales décrites ici peuvent être des outils de dépistage puissants pour évaluer l'efficacité du traitement des blessures de la moelle épinière. Ces traitements peuvent comprendre des inhibiteurs de petites molécules, des médicaments, des produits cellulaires, des greffes de tissu et le traitement combinatoires. L'interaction entre les macrophages, les microglies et les neurones sont également susceptibles de jouer un rôle dans d'autres modèles de maladie de la moelle épinière, y compris la sclérose en plaques, les tumeurs, la méningite et la sclérose latérale amyotrophique, et cette technique peut être utile dans l'étude de ces maladies ainsi .

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The following agencies provided critical funding support for this study: MSTP T32 GM007250 (T.A.E.), 5T32EB7509 (D.S.B.), NCI R01 CA154656 (A.Y.H.), Dana Foundation (A.Y.H.), St. Baldrick’s Foundation (A.Y.H.), Alex’s Lemonade Stand Foundation (A.Y.H.), Gabrielle’s Angel Foundation (A.Y.H.) and Hyundai Hope-on-Wheels Program (A.Y.H.). The authors are thankful for the indispensable help of Jerry Silver and Sarah Busch in learning the Dorsal Column Crush (DCC) injury. The authors are also grateful to Jingquang You, Elisabeth Hare and Hongmei Hu for technical help with genotyping and Ross Anderson for mounting the spinal stabilizing unit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CX3CR1 GFP mice Jackson laboratories 5582
Thy-1 YFP H mice Jackson laboratories 3782
Mouse pie cage Braintree Scientific MPC 2 set
60mm2 petri dish Corning 430166 For bone marrow isolation
Falcon 40 um cell filter Fisher Scientific 08-771-1 For bone marrow isolation 
1x15mL and 1x50mL conical tube Fisher Scientific For bone marrow isolation
16 gauge needle BD 305177 For bone marrow isolation
1ml syringe BD 309628 For bone marrow isolation
ACK lysis buffer Gibco A10492-01 For bone marrow isolation
HBSS Gibco 1E+07 For bone marrow isolation
RPMI media Sigma R8758 For bone marrow isolation
F4/80 antibody Ebioscience 12-4801 PE For FACS verification of chimeras
30-gauge insulin syringe  BD 328280 For tail vein injection 
Spinal Cord Clamps Narshinge STS-A For imaging 
Ortho-Jet Dental Acrylic powder  Lang Dental REF1320 For imaging
Ortho-Jet Dental Acrylic liquid Lang Dental REF1404 For imaging
Gelfoam gelatin sponges Pfizer 9E+06 For imaging
4-0 Ethilon sutures Ethilon 1667G For surgery
Reflex Clips, 7mm Kent Scientific INS750344 For surgery. Sterilize before use
Iris Scissors Fine Science Tools 14061-09 For surgery
45/5 Forceps, Dumoxel Fine Science Tools 11251-35 For surgery
Rongeurs Fine Science Tools 16021-14 For surgery
30 gauge needle BD 305106 For making access holes in dura
Forceps Dumont #4 Biology tips Dumont 11242-40 For surgery
Needle Drivers Fine Science Tools 12002-12 For surgery
Michel Wound Clip Forceps Kent Scientific INS700753 For surgery
Wound clip remover Fine Science Tools 12033-00 For surgery
O-rings for Forceps Fine Science Tools 11200-00 For surgery, Often provided with #4 forceps, can also be ordered separately
Cordless Rechargable Animal trimmer Wahl Series 8900 for surgery
Vetbond 3M 1469SB For surgery
Betadine Solution (10% Providine-Iodine Topical Solution) Purdue Products L.P. NDC 67618-150-08 For surgery
Nair Hair remover lotion Church & Dwight Co., Inc. NRSL-22329-05 For surgery
Isoflurane Butler Schein NDC 11695-6776-2 Drugs – for surgery
Marcaine Henry Schein 6E+06 Drugs – for surgery 1.0 mg/kg given subcutaneously 
Bupernex Henry Schein 121-7793 Drugs – for surgery buprenorphine 0.1 mg/kg
aCSF Chemicals from Sigma 119 mm NaCl For surgery
26.2 mM NaHCO3 From Cold Spring Harbor Protocols
2.5 mM KCl
1 mM NaH2PO4
1.3 mM MgCl2
10 mM glucose 
TRITC-dextran 150,000 MW Sigma T1287 For intravenous administration to label vasculature
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Referências

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Intravital ImagingAxonal InteractionsMicrogliaMacrophagesMouseDorsal Column Crush InjurySpinal Cord InjuryTwo-photon MicroscopyBone Marrow ChimeraLaminectomy

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Evans, T. A., Barkauskas, D. S., Myers, J. T., Huang, A. Y. Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury. J. Vis. Exp. (93), e52228, doi:10.3791/52228 (2014).
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