Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury.
Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. Intra-vital two-photon microscopy enables the study of macrophages and microglia in the spinal cord lesion in the living animal. This can be performed in adult animals with a traumatic injury to the dorsal column. Here, we describe methods for distinguishing macrophages from microglia in the CNS using an irradiation bone marrow chimera to obtain animals in which only macrophages or microglia are labeled with a genetically encoded green fluorescent protein. We also describe a injury model that crushes the dorsal column of the spinal cord, thereby producing a simple, easily accessible, rectangular lesion that is easily visualized in an animal through a laminectomy. Furthermore, we will outline procedures to sequentially image the animals at the anatomical site of injury for the study of cellular interactions during the first few days to weeks after injury.
merkezi sinir sistemi (MSS) hastalık veya yaralanma iltihabi reaksiyon kötü, özellikle doku içinde bağışıklık ve yerleşik hücreleri arasındaki etkileşimler açısından, anlaşılmaktadır. Omurilik bu hücresel etkileşimler araştırmalar canlı bir hayvanda özel bir öneme sahiptir. Sadece kolayca erişilebilir MSS beyaz cevher yolu bu mümkün deneysel yaklaşımı geliştirmeye çaba için önemli bir alan yapım, omurilik dorsal sütunlar bulunmaktadır. Bu araştırmalar nedeniyle erişmek ve görüntüleme için MSS stabilize teknik zorluk sınırlı olmuştur. Omurilik Canlı görüntüleme ilk tetkikten sonra birkaç saat ötesinde bir omurilik yaralanması önce, ancak, birkaç çalışma 1-13 ele hücresel hareketi tarif edilmiştir. travmatik omurilik lezyon nöronlar, astrositler, fibroblastlar, NG2 progenitör hücreleri ve bağışıklık hücreleri includi ile, karmaşık bir ortamdırmikroglia, nötrofiller, makrofajlar, T-hücreleri, B hücreleri ve dendritik hücreler 14,15 ng. Makrofajlar dolaşımdan infiltre lezyonda fagositoz sorumlu bağışıklık hücrelerinde, bir alt kümesidir. Bu fagositik hücrelerin rolü bu hücrelerin yaralı dokuda hasar ve koruyucu rolleri hem alabilir belirten raporları ile tartışma konusu olmuştur. Bu roller yaralı hayvan 21,23,24 fonksiyonel açıklarının bir yara alarak fenotip şifa ve azalan bir yaralanma sonrasında sekonder aksonal tepe kurumalarına artan ve bir fagositik bir şekilde 16-22 hareket aralığı.
Daha önce, öncelikle sağlıklı dokuda morfolojisi dayanıyordu mikrogliada gelen makrofajlar ayırt çalışır. Ancak, aktif mikrogliya ve makrofajlar aynı belirteçlerin birçoğu ifade ve bas çalışmak zordur, bu hücrelerin farklı etkinlikler ayrılmasını yapma, yaralanma 25-29 sonra ayırt morfolojisi gösterilecek30 yalnız bu faktörlere ed. Bu yaklaşım, in vivo olarak, bu hücre tiplerinin ayırt edilmesi daha az yararlı olmasına rağmen, bu hücreler, 33,34, akış sitometrisi kullanılarak CD45 ayırıcı ifadesi ile ayrılabilir. Monositler gibi bu belirteçlerin ifadesi dinamik değişimler doğru analiz 35,36 komplike edebilir makrofajlar içine ayırt rağmen mikroglia ve makrofajlar içinde CCR2 ve CX3CR1 ve kullanmak diferansiyel ifadesi de, araştırılmaktadır. Makrofajlar kemik iliği atalarıdır türetilen ve bir hakaret 31,32 sonra yaralı MSS girmek sırasında mikroglia, MSS ikamet bağışıklık hücreleri ve fetal gelişim sırasında sarısı kesesi atalarıdır kaynaklanmaktadır. Bu iki hücre tiplerini ayırt etmek morfoloji kullanarak alternatif bir yaklaşım MSS ikamet korurken, donör atalarıdır türetilen makrofajlar izlenebilir işaretleyici ifade eden bir donör hayvandan atalarıdır ile kemik iliği değiştirmektir, tilki kuyruğutakabilir türetilen mikroglia. Bu kemik iliği kimerik modelleri yaygın pek çok diğer uygulama 37-40 kullanılmaktadır. Bu yöntem, bu nedenle belirli uygulamalardaki kullanımını sınırlamaktadır konakçıda, ilik progenitörlerinden ortadan kaldırmak için, kullanılan ışıma ya da sitotoksik ilaçların neden olduğu kan-beyin engelinin bütünlüğüne hasar ile ilişkili benzeri olmayan uyarılar yer alır. Son zamanlarda, MSS mikroglia ve makrofajlar arasındaki işlevsel farklılıklar flow sitometri, gen çip dizisi analizi ve gelecekte çok yararlı olacağını kimerizm yöntemleri 24,26,41-44 kullanarak ayırt edilmesi başlıyor. Bu iki hücre tipleri ayıran zor olmasına rağmen, kendilerine özgü işlevleri anlamak CNS içinde hem de mikroglianın ve makrofajlar içeren bozuklukların daha hedefli tedaviler yol açan önemlidir.
Spinal kordon hasarı hücresel etkileşimler Açıklaması ilk olarak hücre kültürü modelleri çalışmalardan elde gelmiştir. Bu dcanlı bir hayvanda bir araya görüntüleme spinal kordon hasarı ve bağışıklık hücreleri ile ilgili sorunlara vi. Değişen tipine ve şiddetine spinal kord yaralanması Güncel kemirgen modelleri kontüzyon modelleri 45,46, pin-prick yaralanmalar 2, laserasyon 47, ve burada 16,18,48 açıklanan dorsal kolon ezilme yaralanması bulunmaktadır. Meninkslerde Enflamasyon yaralanma şiddeti artar ve seri görüntüleme için pencere veya cerrahi implantasyon için benzersiz zorluklar oluşturmaktadır. Bu sorunlardan bazıları fagositik hücrelerin infiltrasyonu yanı sıra cerrahi sitesi üzerinden fibröz doku oluşumunu içerir. Dorsal kolon ezilme yaralanması incelemek için buraya yapıldığı gibi, bu konuların bazıları, küçük lezyonlar oluşturmak ve dura ve sonraki yeniden açılması ameliyatı için izin paraspinöz kaslar arasındaki olmayan bağışıklık cerrahi pansuman ile maruz omurilik kapsayan üstesinden gelinebilir . Spin görüntü sadece dorsal kısmı yeteneğikontüzyon modelleri öncelikle sık yaralanma 45,49 sonra özellikle erken zaman noktalarında, sırt sütunların en dorsal kısmını koruyucu, merkez kordon zarar beri el kablosu da, yaralanma seçim sınırlar. Bu nedenle, lezyon içi ve lezyona aksonal konumda kolayca ölçümü için hücre hareketinin gözlenmesi için yararlıdır olan temiz, tekrarlanabilir, dikdörtgen şekilli bir lezyon verir, basit bir yaralanma modeli açıklar.
Gerçek zamanlı olarak patolojiyi izleyen sırasında kendi doğal doku bölümlerinde farklı hücre tiplerinin Görüntüleme etkileşimleri büyük ilgi yarattı. MSS, hücre-hücre teması yoğun ağ içinde ve komşu hücrelerle sinyal normal fonksiyon ve MSS patolojiyi anlamak için gereklidir. Burada, spinal kord mekanik lezyon içinde hücresel hareketin gözlem için 2-foton lazer tarama mikroskobu kullanımı nitelendirdi. Cerrahi ve doku hazırlık kalitesinin yanı sıra, doku mekanik stabilite başarılı time-lapse mikroskobu, hareket objeyi nefes spinal kord özellikle izolasyonu için her şeyden önemlidir. Stabilite hayvanın kalp atış hızı ve solunum tekabül eden bir mikroskop altında, omurilik hareketi için ideal ile değerlendirilebilir. Cerrahi performans ve ayrıca görüntüleme başlamadan hemen önce ise Kararlılık hem değerlendirilmelidir. Anima Eğerl ayarlamaları omurilik kelepçeler yerleştirme ve gerginlik yapılmalıdır, istikrarlı değildir. Kemik iliği kimera yaklaşımları ile birlikte hücre tipi özel flüoresan raportör fare modelleri mikroglia ve akson karşı monositik hücrelerin tanımlanmasına izin vermiştir. Önceki çalışmalar, kan türevi monositler ve mikroglia burada 43 tarif metodoloji kullanılarak travma sonrası ikincil akson hasar için sorumlu olduğunu ortaya koymuştur. Dextran'ın konjuge damar boya hem işaretlerini sağlamak ve damar bütünlüğü ihlalleri tespit etmek damar tanımlama sağlar. Uygun flüoresan raportör fare modelinde seçimi arzu edilen hücre tipleri uygun bir şekilde tanımlanması görüntülü izin vermek için çok önemlidir.
Üstlenilen çalışmalar için uygun floresan fare modellerinin geliştirilmesi de deneylerin başarısı için kritik öneme sahiptir. CX3CR1 + / GFP iki fagositik nüfus ayırt </sup> MSS hücreleri geleneksel zor olmuştur. Burada gösterildiği gibi, ortak bir immünolojik teknik, ışınlama kimeralar, kemik iliği türevli makrofajlar radyo dayanıklı, merkezi sinir sistemi yerleşik mikroglia ayırmak için kullanılabilir. ışınlama işlemi hücre fenotipleri kan beyin bariyerini zarar ve değiştirme potansiyeline sahiptir, bu nedenle bu modelin kullanımı dikkatle düşünülmelidir. Bu değişikliklerin ölçüde radyasyon dozu hem de geri kazanım dönemi süresi farklıdır ve farklı ateşli modelleri üzerindeki etkisi tam olarak incelenmemiştir. merkezi sinir sistemi, kan-beyin bariyeri ile ışınlama etkileri uygulama sırasında kafa koruyucu ile minimize edilebilir ve bu, omurilik, doğrudan 52 korunmamış olsa bile, aydınlatmadan sonra, omurilik içine, hücre sızmasını azaltmak için gösterilmiştir. Burada kimera oluşmasının bir sonucu olarak kalıcı halde CNS'ye nüfuz eden hücre sayısı uyuşmuş aksine önemsiz olduğunu gözlemiştirlezyon giren hücrelerin er. Dikkate diğer alternatif modeller ilaca bağlı kimeralar 52 veya Parabiyotik fare modelleri 53 içermektedir.
Burada, biz 2-foton mikroskopi kullanılarak görüntü kolay omurilik dorsal beyaz cevherde bir lezyon ile sonuçlanan, belirli basit ve tekrarlanabilir küçük yaralanma modeli sunduk. Bu yöntem aynı zamanda literatürde tamamlayıcı sabit doku analizi 16,18,43,48,54 ile birleştiğinde olmuştur dorsal sütunları aksonal kurumaları derecesini tahlil için ölçülebilir lezyon sağlar. Bu modelde, hayvanlar sadece asgari açıkları görüntülemek ve yaralanma sonrası özel bakım gerektirir. Burada anlatılan dorsal kolon ezilme yaralanması ve görüntüleme teknikleri kullanılarak gelecekteki çalışmalar spinal kord yaralanması tedavisinin etkinliğini değerlendirmek için güçlü tarama araçları olabilir. Bu tedaviler, küçük molekül inhibitörleri, ilaçlar, hücre ürünleri, doku greftleri ve kombinasyon tedavisi bulunabilirs. makrofajlar, mikroglia ve nöronlar arasındaki etkileşim ayrıca, çoklu skleroz, tümör, menenjit ve amiyotrofik lateral skleroz, omurilik diğer hastalık modellerinde, bir rol oynaması olasıdır ve bu teknik de bu hastalıkların incelenmesinde yararlı olabilir .
The authors have nothing to disclose.
The following agencies provided critical funding support for this study: MSTP T32 GM007250 (T.A.E.), 5T32EB7509 (D.S.B.), NCI R01 CA154656 (A.Y.H.), Dana Foundation (A.Y.H.), St. Baldrick’s Foundation (A.Y.H.), Alex’s Lemonade Stand Foundation (A.Y.H.), Gabrielle’s Angel Foundation (A.Y.H.) and Hyundai Hope-on-Wheels Program (A.Y.H.). The authors are thankful for the indispensable help of Jerry Silver and Sarah Busch in learning the Dorsal Column Crush (DCC) injury. The authors are also grateful to Jingquang You, Elisabeth Hare and Hongmei Hu for technical help with genotyping and Ross Anderson for mounting the spinal stabilizing unit.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
CX3CR1 GFP mice | Jackson laboratories | 5582 | |
Thy-1 YFP H mice | Jackson laboratories | 3782 | |
Mouse pie cage | Braintree Scientific | MPC 2 set | |
60mm2 petri dish | Corning | 430166 | For bone marrow isolation |
Falcon 40 um cell filter | Fisher Scientific | 08-771-1 | For bone marrow isolation |
1x15mL and 1x50mL conical tube | Fisher Scientific | For bone marrow isolation | |
16 gauge needle | BD | 305177 | For bone marrow isolation |
1ml syringe | BD | 309628 | For bone marrow isolation |
ACK lysis buffer | Gibco | A10492-01 | For bone marrow isolation |
HBSS | Gibco | 1E+07 | For bone marrow isolation |
RPMI media | Sigma | R8758 | For bone marrow isolation |
F4/80 antibody | Ebioscience | 12-4801 PE | For FACS verification of chimeras |
30-gauge insulin syringe | BD | 328280 | For tail vein injection |
Spinal Cord Clamps | Narshinge | STS-A | For imaging |
Ortho-Jet Dental Acrylic powder | Lang Dental | REF1320 | For imaging |
Ortho-Jet Dental Acrylic liquid | Lang Dental | REF1404 | For imaging |
Gelfoam gelatin sponges | Pfizer | 9E+06 | For imaging |
4-0 Ethilon sutures | Ethilon | 1667G | For surgery |
Reflex Clips, 7mm | Kent Scientific | INS750344 | For surgery. Sterilize before use |
Iris Scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | For surgery |
45/5 Forceps, Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-35 | For surgery |
Rongeurs | Fine Science Tools | 16021-14 | For surgery |
30 gauge needle | BD | 305106 | For making access holes in dura |
Forceps Dumont #4 Biology tips | Dumont | 11242-40 | For surgery |
Needle Drivers | Fine Science Tools | 12002-12 | For surgery |
Michel Wound Clip Forceps | Kent Scientific | INS700753 | For surgery |
Wound clip remover | Fine Science Tools | 12033-00 | For surgery |
O-rings for Forceps | Fine Science Tools | 11200-00 | For surgery, Often provided with #4 forceps, can also be ordered separately |
Cordless Rechargable Animal trimmer | Wahl | Series 8900 | for surgery |
Vetbond | 3M | 1469SB | For surgery |
Betadine Solution (10% Providine-Iodine Topical Solution) | Purdue Products L.P. | NDC 67618-150-08 | For surgery |
Nair Hair remover lotion | Church & Dwight Co., Inc. | NRSL-22329-05 | For surgery |
Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-2 | Drugs – for surgery |
Marcaine | Henry Schein | 6E+06 | Drugs – for surgery 1.0 mg/kg given subcutaneously |
Bupernex | Henry Schein | 121-7793 | Drugs – for surgery buprenorphine 0.1 mg/kg |
aCSF | Chemicals from Sigma | 119 mm NaCl | For surgery |
26.2 mM NaHCO3 | From Cold Spring Harbor Protocols | ||
2.5 mM KCl | |||
1 mM NaH2PO4 | |||
1.3 mM MgCl2 | |||
10 mM glucose | |||
TRITC-dextran 150,000 MW | Sigma | T1287 | For intravenous administration to label vasculature |