Neuromuscular जंक्शन: माप Synapse आकार, confocal प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग Synaptic प्रोटीन घनत्व में विखंडन और परिवर्तन
Summary
The neuromuscular junction (NMJ) is altered in a variety of conditions that can sometimes culminate in synaptic failure. This report describes fluorescence microscope-based methods to quantify such structural changes.
Abstract
neuromuscular जंक्शन (NMJ) स्तनधारी मोटर न्यूरॉन्स स्वैच्छिक मांसपेशियों में संकुचन को नियंत्रित जिसके माध्यम से बड़े, कोलीनर्जिक रिले अन्तर्ग्रथन है। NMJ में संरचनात्मक परिवर्तन कमजोरी, शोष और मांसपेशियों के फाइबर की भी मौत में जिसके परिणामस्वरूप, neurotransmission विफलता में परिणाम कर सकते हैं। कई अध्ययनों से आनुवंशिक संशोधन या रोग माउस NMJ की संरचना बदल सकते हैं कि कैसे जांच की है। दुर्भाग्य से, यह सीधे वे अक्सर विभिन्न मापदंडों और विश्लेषणात्मक तरीकों कार्यरत क्योंकि इन अध्ययनों के निष्कर्षों से तुलना करने के लिए मुश्किल हो सकता है। तीन प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित हैं। पहले acetylcholine रिसेप्टर (ACHR) के क्षेत्र को मापने के लिए अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण confocal छवियों का उपयोग करता है endplate और overlying प्रीसानेप्टिक तंत्रिका टर्मिनल में synaptic पुटिका धुंधला के क्षेत्र में अमीर पोस्टअन्तर्ग्रथनी झिल्ली डोमेन। दूसरा प्रोटोकॉल पोस्टअन्तर्ग्रथनी झिल्ली में synaptic प्रोटीन के लिए immunostaining के रिश्तेदार तीव्रता तुलना करती है। तीसरे जनसंपर्कotocol endplate पर पोस्टअन्तर्ग्रथनी AChRs की पैकिंग में परिवर्तन का पता लगाने के लिए प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) का उपयोग करता है। प्रोटोकॉल विकसित किया है और अध्ययन की एक श्रृंखला से अधिक परिष्कृत किया गया है। गुणवत्ता और परिणाम की स्थिरता को प्रभावित करने वाले कारकों पर विचार विमर्श कर रहे हैं और प्रामाणिक डेटा स्वस्थ युवा वयस्क चूहों में NMJs के लिए प्रदान की जाती हैं।
Introduction
neuromuscular जंक्शन (NMJ) तंत्रिका तंत्र और कंकाल की मांसपेशी के बीच संचार की मध्यस्थता करता है कि महत्वपूर्ण रिले अन्तर्ग्रथन है। यह सब स्वैच्छिक आंदोलन के लिए आवश्यक है। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी लंबे NMJ 1-3 माउस पर ट्रांसजीन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए या कृंतक NMJs 4-11 पर उम्र, आहार, व्यायाम और रोग के प्रभाव की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इस तरह के अध्ययन NMJ के फिजियोलॉजी और pathophysiology के बारे में हमें ज्यादा सिखाया है, लेकिन विविध मानकों (जैसे, ACHR क्षेत्र, endplate क्षेत्र, परिधि की लंबाई, विखंडन सूचकांकों) अक्सर यह मुश्किल इन अध्ययनों के निष्कर्षों की तुलना करने के लिए बनाने की सूचना दी। पूर्व नैदानिक शोधकर्ताओं ने विशेष रूप से बीमारी 12 के कृंतक मॉडल के साथ पढ़ाई में, reproducibility के प्रदर्शित करने के लिए सक्षम होने के लिए एक बढ़ती हुई उम्मीद नहीं है। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल, विकासात्मक शारीरिक और pathophysiological चर्चा की जांच की है कि अध्ययन की एक श्रृंखला के माध्यम से परिष्कृत किया गयाNMJ को anges। इस तरह के अध्ययन माउस मोटर endplate पर synaptic विशेषज्ञताओं का क्षेत्र और postsynaptic विशेषज्ञताओं 13-15 भीतर synaptic प्रोटीन की पैकिंग के सापेक्ष घनत्व की माप की आवश्यकता होती है।
इन तरीकों की उपयोगिता मियासथीनिया ग्रेविस विरोधी कस्तूरी की एक माउस मॉडल में हाल के अध्ययनों से यह साफ है। विरोधी कस्तूरी पॉजिटिव myasthenia से आईजीजी के दैनिक इंजेक्शन वयस्क चूहों में रोगियों के लिए उन्हें दो सप्ताह 16 के भीतर कमजोर बनने के लिए कारण कामला। पेशी (तंत्रिका-टर्मिनलों में) synaptophysin के लिए डबल लेबल रहे थे कि वर्गों और पोस्टअन्तर्ग्रथनी AChRs के confocal अधिकतम प्रक्षेपण छवियों प्राथमिक परिवर्तन के रूप में ACHR धुंधला के क्षेत्र में एक प्रगतिशील गिरावट का पता चला। गिरावट की महत्वपूर्ण बात यह दर सिनेप्टिक क्षमता, synaptic प्रसारण और मांसपेशियों में कमजोरी 17,18 की विफलता के आयाम में तुलनीय गिरावट आती है समझाने के लिए पर्याप्त था। गुणात्मक इसी तरह के निष्कर्ष अन्य अनुसंधान समूहों द्वारा सूचित किया गया है10,19। एक ही NMJ माप तरीकों के बाद से इस माउस मॉडल 20,21 में कामला विरोधी कस्तूरी myasthenia के इलाज के लिए तीन दवाओं के प्रभाव का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।
आसीन उम्र बढ़ने न्यूरोमस्कुलर कनेक्शनों की हानि हो सकती है। चूहों बुढ़ापे में प्रगति के रूप में यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल मोटर endplates में तंत्रिका टर्मिनल synaptophysin के क्षेत्र में एक उम्र जुड़े गिरावट से पता चला है। एक ही तरीके का स्वैच्छिक व्यायाम काफी हद तक अन्य समूहों 4 द्वारा पिछले काम के साथ संगत प्रीसानेप्टिक तंत्रिका टर्मिनल क्षेत्र 22 में कमी, रोकने सकता है कि पता चला। न्यूरोमस्कुलर कनेक्शनों की हानि भी amyotrophic पार्श्व काठिन्य 9,23 के SOD1G93A माउस मॉडल में होता है।
जैसा कि ऊपर उल्लेख पढ़ाई स्वास्थ्य की स्थिति की एक किस्म NMJ पर पूर्व या बाद synaptic विशेषज्ञताओं या तो के क्षेत्र में कटौती करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं कि प्रदर्शित करता है। इस बिगड़ा अन्तर्ग्रथनी मज़ा में हो सकता हैction के न्यूरोमस्कुलर कनेक्शन का पूरा नुकसान का सूत्रपात हो सकता है या। तीन प्रोटोकॉल क्षेत्र और synaptic विशेषज्ञताओं के घनत्व के quantitation की अनुमति है कि वर्णित हैं। पहले प्रोटोकॉल का उद्देश्य प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग, पूर्व और बाद synaptic विशेषज्ञताओं और स्तनधारी NMJs पर अपने संरेखण के क्षेत्रों में से एक व्यावहारिक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य उपाय प्रदान करना है। दो आयामी अधिकतम प्रक्षेपण confocal छवियों और एनआईएच ImageJ के साथ छवि विश्लेषण synaptophysin धुंधला (synaptic vesicles), पोस्टअन्तर्ग्रथनी AChRs और synaptic ओवरलैप क्षेत्र के क्षेत्र में परिवर्तन का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है। अन्तर्ग्रथनी विशेषज्ञता के क्षेत्र विचार करने के लिए प्रयोग किया जाता है दृश्य सूचना को अधिकतम करने के लिए इतनी के रूप में confocal इमेजिंग मानकों (लाभ और स्तर ऑफसेट) प्रत्येक NMJ के लिए अनुकूलित कर रहे हैं। Neuromuscular विफलता भी पोस्टअन्तर्ग्रथनी ACHR और / या अन्य अन्तर्ग्रथनी प्रोटीन के घनत्व में परिवर्तन से परिणाम कर सकते हैं। दूसरा प्रोटोकॉल पोस्टअन्तर्ग्रथनी प्रोटीन इस तरह के सापेक्ष घनत्व में परिवर्तन का पता लगाने के लिए आवेदन किया जा सकता हैकस्तूरी, rapsyn, dystroglycan, phosphorylated एसआरसी kinase और phosphorylated ACHR 18,21 के रूप में।
मियासथीनिया ग्रेविस में, पोस्टअन्तर्ग्रथनी झिल्ली के भीतर ACHR का एक कम घनत्व अन्तर्ग्रथनी विफलता और मांसपेशियों में कमजोरी का तात्कालिक कारण है। तीसरे प्रोटोकॉल पोस्टअन्तर्ग्रथनी झिल्ली 14,15 भीतर आसन्न AChRs की निकटता में परिवर्तन का आकलन करने के लिए एक प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) विधि का वर्णन है। इस विधि फ्लोरोसेंट-α-bungarotoxin (BGT) के साथ लेबल पड़ोसी AChRs के बीच ऊर्जा हस्तांतरण का पता लगाता है। फ्लोरोसेंट दाता और स्वीकर्ता जांच कम से कम 10 एनएम के अलावा हैं जब झल्लाहट ही होता है। यह सीधे सिनेप्टिक क्षमता के आयाम से संबंधित हो सकता है कि ACHR पैकिंग की जकड़न में (submicroscopic) परिवर्तन प्रकट कर सकते हैं।
पिछले एक दशक से अधिक परिष्कृत ये तीन प्रोटोकॉल, एक सुसंगत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य रास्ते में NMJ अखंडता के पूरक के उपाय प्रदान करते हैं। मानकीकृत प्रोटोकॉल एक का प्रयोग करेंएन डी मापदंडों स्तनधारी NMJ पर जीन और पर्यावरण के हस्तक्षेप के प्रभाव की तुलना की सुविधा होनी चाहिए।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल मज़बूती से मापने के लिए और सामान्य उम्र बढ़ने और रोग राज्यों सहित स्थितियों की एक श्रृंखला भर में NMJ के गुणों में परिवर्तन यों के लिए सक्षम है। एन के लिए वर्णित विधि NMJ छवियों शोधकर…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the National Health and Medical Research Council [570930]. Imaging was carried out at the Bosch Institute Advanced Microscopy Facility. Former members of the lab, whose work is cited, are thanked for their contributions to developing these methods.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Scanning confocal microscope | Leica | DM IRE2 with TCS SP2 system | Most scanning confocal microscopes should be suitable. |
| Zeiss | LSM 510 Meta | ||
| Leica | SPE-II | ||
| Alexa555-a-bungarotoxin (red-BGT) | Life technologies | B35451 | Used for labelling AChRs |
| Alexa647-α-bungarotoxin (far-red-BGT) | Life technologies | B35450 | Far red fluorescence: barely visible through the eyepiece |
| rabbit anti-synaptophysin | Life technologies | 18-0130 | Different batches of primary antibody differ in effective working dilution |
| FITC-anti-rapsyn mab1234 | Milipore | FCMAB134F | Monoclonal antibody conjugated to FITC |
| FITC-donkey anti-rabbit IgG | Jackson | 711-095-152 | Polyclonal secondary antibodies can vary in quality according to source and batch |
| Optimal Cutting Temperature compound (O.T.C.) | ProSciTech | IA018 | Cryostat embedding matrix for freezing muscles |
| DABCO | Sigma | 10981 | Mounting medium that slows photobleaching of fluorophors |
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