Den neuromuskulære junction (NMJ) er den kritiske relæ synapse, der medierer kommunikation mellem nervesystemet og skeletmuskulatur. Det er nødvendigt for alle frivillige bevægelser. Fluorescensmikroskopi har længe været anvendt til at undersøge virkningerne af transgener på musen NMJ ^1-3 eller for at sammenligne virkningerne af alder, kost, motion og sygdom ved gnavere NMJs ^4-11. Sådanne undersøgelser har lært os meget om fysiologi og patofysiologi af NMJ, men de forskellige parametre rapporteret (f.eks AChR område, endepladens område, perimeter længde, fragmentering indeks) ofte gør det vanskeligt at sammenligne resultaterne af disse undersøgelser. Der er en stigende forventning til prækliniske forskere til at kunne påvise reproducerbarhed, især i studier med gnavermodeller på sygdom ^12. De her beskrevne protokoller blev forfinet gennem en række undersøgelser, der undersøgte udviklingsmæssige, fysiologiske og patofysiologiske lmanges til NMJ. Sådanne undersøgelser kræver måling af arealet af synaptiske specialiseringer på musen motor endeplade og den relative tæthed af pakning af synaptiske proteiner i postsynaptiske specialer ^13-15.

Anvendeligheden af ​​disse metoder er illustreret af nylige undersøgelser i en musemodel af anti-moskus myasthenia gravis. Daglige injektioner af IgG fra anti-Musk-positive myasthenia gravis patienter i voksne mus fik dem til at blive svag inden for 2 uger ^16. Konfokale maksimal projektion billeder af muskel sektioner, der var dobbelt-mærket til synaptophysin (i nerve-terminaler) og postsynaptiske AChRs viste en gradvis nedgang i området AChR farvning som det primære ændring. Vigtigere hastigheden af faldet var tilstrækkelig til at forklare sammenlignelige fald i amplituden af synaptiske potentialer, svigt af synaptisk transmission og muskelsvaghed ^17,18. Kvalitativt lignende resultater blev rapporteret af andre forskergrupper^10,19. Er siden blevet brugt De samme NMJ målemetoder til at vurdere virkningen af tre lægemidler til behandling af anti-Musk myasthenia gravis i denne musemodel ^20,21.

Stillesiddende aldring kan føre til tab af neuromuskulære forbindelser. De her beskrevne protokoller har afsløret en alder-associeret nedgang inden for nerve terminal synaptophysin ved motoriske endeplader som mus fremskridt i alderen. De samme metoder viste, at frivillig øvelse i høj grad kunne forhindre reduktion i præsynaptiske nerve terminalområde ^22, i overensstemmelse med tidligere arbejde med andre grupper ^4. Tab af neuromuskulære forbindelser forekommer også i SOD1G93A musemodel for amyotrofisk lateral sklerose ^9,23.

Ovennævnte undersøgelser viser, at en række forskellige sundhedsmæssige betingelser kan føre til en reduktion i det område, enten før eller efter synaptiske specialiseringer på NMJ. Dette kan resultere i nedsat synaptisk sjovIndsatsen eller kan varsle fuldstændigt tab af den neuromuskulære forbindelse. Tre protokoller beskrives som tillader kvantificering af området og tæthed af synaptiske specialer. Formålet med den første protokol er at give en praktisk og reproducerbar måling af områderne før og efter synaptiske specialiseringer og deres tilpasning ved pattedyrs NMJs, anvendelse af fluorescens mikroskopi. Todimensionale maksimale projektion konfokale billeder og billedanalyse med NIH ImageJ bruges til at påvise ændringer i området synaptophysin farvning (synaptiske vesikler), postsynaptiske AChRs og synaptisk overlappende område. Konfokale imaging parametre (gain og offset-niveau) er optimeret for hver NMJ således at maksimere den visuelle information til at skelne det område af synaptisk specialisering. Neuromuskulær fiasko kan også skyldes ændringer i tætheden af ​​postsynaptiske AChR og / eller andre synaptiske proteiner. Den anden protokol kan anvendes til at detektere ændringer i den relative massefylde af postsynaptiske proteiner, såsomsom moskus, RapSyn, dystroglycan, phosphoryleret Src kinase og phosphoryleret AChR ^18,21.

I myasthenia gravis, en reduceret tæthed af AChR i den postsynaptiske membran er den umiddelbare årsag til synaptisk svigt og muskelsvaghed. Den tredje protokol beskriver en fluorescensresonansenergioverførsel (FRET) metode til at vurdere ændringer i nærhed af tilstødende AChRs inden postsynaptiske membraner ^14,15. Denne metode detekterer energioverførsel mellem tilstødende AChRs mærket med fluorescerende-α-bungarotoxin (BGT). FRET forekommer kun, når de fluorescerende donor- og acceptor-prober er mindre end 10 nm fra hinanden. Dette kan afsløre (submikroskopiske) ændringer i tæthed AChR emballage, der direkte vedrører amplituden af ​​synaptiske potentialer.

Disse tre protokoller, raffinerede i det seneste årti, giver supplerende foranstaltninger af NMJ integritet i en konsekvent og reproducerbar måde. Anvendelse af standardiserede protokoller and parametre bør lette sammenligning af virkningerne af gener og miljømæssige tiltag upon pattedyrs NMJ.