Den neuromuskulära förbindelsen (NMJ) är den kritiska relä synapsen som förmedlar kommunikationen mellan nervsystemet och skelettmuskulaturen. Det krävs för alla frivilliga rörelser. Fluorescensmikroskopi har länge använts för att studera effekterna av transgener på musen NMJ ^1-3 eller att jämföra effekterna av ålder, kost, motion och sjukdom vid gnagare NMJs ^4-11. Sådana studier har lärt oss mycket om fysiologi och patofysiologi NMJ, men de olika parametrarna rapporterades (t.ex. AChR område, ändskivans area, omkrets längd, fragmenteringsindex) ofta gör det svårt att jämföra resultaten från dessa studier. Det finns ett ökande förväntan för prekliniska forskare kunna påvisa reproducerbarhet, särskilt i studier med gnagare modeller av sjukdomen ^12. De protokoll som beskrivs här har förfinats genom en rad studier som undersökt utvecklings, fysiologiska och patofysiologiska lmAnges till NMJ. Sådana studier kräver mätning av området med synaptiska inriktningar på musen motorändplattan och den relativa densiteten av packning av synaptiska proteiner inom postsynaptiska inriktningar ^13-15.

Användbarheten av dessa metoder illustreras av nyligen genomförda studier i en musmodell av anti-MuSK myasthenia gravis. Dagliga injektioner av IgG från anti-mysk positiva myasthenia gravis patienter till vuxna möss fick dem att bli svag inom 2 veckor ^16. Konfokala maximal projektionsbilder av muskelsektioner som dubbel märkta för synaptofysin (i nervterminaler) och postsynaptiska AChRs avslöjade successivt minskade inom AChR färgning som den primära förändringen. Viktigt nedgången var tillräcklig för att förklara jämförbara minskningar i amplituden av synaptiska potentialer, fel på synaptisk transmission och muskelsvaghet ^17,18. Kvalitativt liknande fynd rapporterades av andra forskargrupper^10,19. Samma NMJ mätmetoder har sedan använts för att bedöma effekten av tre läkemedel för behandling av anti MuSK myasthenia gravis i denna musmodell ^20,21.

Stillasittande åldrande kan leda till förlust av neuromuskulära anslutningar. De protokoll som beskrivs här har avslöjat en åldersassocierade nedgång inom nervändsluten synaptofysin vid motor ändplattor som möss utvecklas i hög ålder. Samma metoder avslöjade att frivillig träning i stort sett skulle kunna hindra minskningen av presynaptiska nervterminalområde ^22, i linje med tidigare arbeten av andra grupper ^4. Förlust av neuromuskulära kopplingar förekommer också i SOD1G93A musmodell av amyotrofisk lateralskleros ^9,23.

Studierna som nämns ovan visar att en mängd olika hygienkrav kan leda till minskningar i området antingen före eller efter synaptiska inriktningar på NMJ. Detta kan resultera i försämrad synaptiska kulInsatser eller kan förebåda total förlust av den neuromuskulära anslutningen. Tre protokoll beskrivs som tillåter kvantifiering av området och densiteten av synaptiska inriktningar. Syftet med det första protokollet är att ge en praktisk och reproducerbart mått områdena före och postsynaptiska inriktningar och deras anpassning till däggdjurs NMJs, med hjälp av fluorescens mikroskopi. Tvådimensionella maximala projektions konfokala bilder och bildanalys med NIH ImageJ används för att upptäcka förändringar i området synaptofysin färgning (synaptiska vesikler), postsynaptiska AChRs och synaptic överlappning området. Konfokala avbildningsparametrar (gain och offset nivå) är optimerade för varje NMJ för att maximera den visuella information som används för att urskilja området synaptiska specialisering. Neuromuskulär misslyckande kan också bero på förändringar i tätheten av postsynaptiska AChR och / eller andra synaptiska proteiner. Den andra protokollet kan tillämpas för att upptäcka förändringar i den relativa tätheten av postsynaptiska proteiner sådanasom mysk, RapSyn, dystroglycan, fosforyleras Src kinas och fosforyleras AChR ^18,21.

I myasthenia gravis, är en reducerad densitet av AChR inom det postsynaptiska membranet den omedelbara orsaken till synaptiska misslyckande och muskelsvaghet. Den tredje protokoll beskriver en Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) metod för att bedöma förändringar i närheten av intilliggande AChRs inom postsynaptiska membran ^14,15. Denna metod upptäcker energiöverföring mellan grann AChRs märkta med fluorescerande-α-bungarotoxin (BGT). FRET sker endast när de fluorescerande donator- och acceptor-prober är mindre än 10 nm från varandra. Detta kan avslöja (submikroskopiska) förändringar i täthet AChR packning som direkt kan avse amplituden av synaptiska potentialer.

Dessa tre protokoll, raffinerade under det senaste decenniet, ger kompletterande åtgärder av NMJ integritet i en konsekvent och reproducerbart sätt. Användning av standardiserade protokoll and parametrar bör underlätta jämförelser av effekterna av gener och miljö ingripanden vid däggdjur NMJ.