A junção neuromuscular (JNM) é a sinapse relé crítico que medeia a comunicação entre o sistema nervoso e no músculo esquelético. Ela é necessária para todo o movimento voluntário. A microscopia de fluorescência tem sido utilizada para estudar os efeitos de transgenes no rato JNM ^1-3 ou para comparar os efeitos da idade, dieta, exercício e doença agravada por NMJs roedor ^4-11. Tais estudos têm nos ensinado muito sobre a fisiologia e fisiopatologia da JNM, mas os diversos parâmetros relatados (por exemplo, a área AChR, área de placa motora, comprimento perímetro, os índices de fragmentação), muitas vezes tornam difícil comparar os resultados desses estudos. Existe a expectativa de aumentar para os investigadores pré-clínicos para ser capaz de demonstrar a reprodutibilidade, particularmente em estudos com modelos de roedores de doença ^12. Os protocolos descritos aqui foram refinados através de uma série de estudos que investigaram ch desenvolvimento, fisiológico e fisiopatológicoanges ao JNM. Tais estudos exigem medição da área de especializações sinápticas na placa motora do mouse, a densidade relativa de embalagem de proteínas sinápticas dentro especializações pós-sinápticos ^13-15.

A utilidade destes métodos é ilustrada por estudos recentes em um modelo de rato anti-almíscares miastenia gravis. Injeções diárias de IgG de miastenia anti-Musk-positivo gravis pacientes em camundongos adultos fez com que eles se tornam fracos dentro de 2 semanas ^16. Imagens de projecção máxima das secções confocais musculares que foram duplamente marcadas para a sinaptofisina (a-terminais nervosas) e pós-sinápticos AChRs revelou um declínio progressivo na área de coloração AChR como a principal alteração. É importante salientar a taxa de declínio foi suficiente para explicar declínios comparáveis ​​na amplitude dos potenciais sinápticos, falha da transmissão sináptica e fraqueza muscular ^17,18. Qualitativamente achados semelhantes foram relatados por outros grupos de pesquisa^10,19. Os mesmos métodos de medição JNM já foram utilizadas para avaliar o impacto de três fármacos para o tratamento anti-almíscares miastenia gravis neste modelo de ratinho ^20,21.

Envelhecimento sedentário pode levar à perda de conexões neuromusculares. Os protocolos descritos aqui revelaram um declínio associado à idade na área do terminal nervoso synaptophysin em placas motoras como ratos progredir na velhice. Os mesmos métodos revelou que o exercício voluntário poderia, em grande parte impedir a redução da área terminal do nervo pré-sináptico ^22, de acordo com o trabalho anterior por outros grupos de ^quatro. Perda de conexões neuromusculares também ocorre no modelo de rato SOD1G93A esclerose lateral amiotrófica ^9,23.

Os estudos citados demonstram que uma variedade de condições de saúde pode levar a reduções na área de uma das especializações pré ou pós-sinápticos no NMJ. Isso pode resultar em diversão sináptica prejudicadacção ou podem anunciar perda completa da ligação neuromuscular. Três protocolos estão descritos que permitem a quantificação da área e densidade de especializações sinápticos. O objectivo do primeiro protocolo é o de proporcionar uma medida prática e reprodutível das áreas de pré- e pós-sinápticos especializações e o seu alinhamento em NMJs de mamífero, utilizando microscopia de fluorescência. Bidimensionais imagens máximos projeção confocal e análise de imagem com NIH ImageJ é usado para detectar mudanças na área de coloração synaptophysin (vesículas sinápticas), AChRs pós-sinápticos e área de sobreposição sináptica. Parâmetros confocal de imagem (ganho e nível de deslocamento) são optimizados para cada NMJ de modo a maximizar a informação visual usado para discernir a área de especialização sináptica. Falha neuromuscular também pode resultar de alterações na densidade do RACh pós-sináptico e / ou outras proteínas sinápticas. O segundo protocolo pode ser aplicado para detectar alterações na densidade relativa de proteínas pós-sinápticos taiscomo almíscares, rapsyn, distroglicana, fosforilado Src quinase e fosforilado AChR ^18,21.

Em pacientes com miastenia gravis, uma densidade reduzida de AChR dentro da membrana pós-sináptica é a causa imediata da falha sináptica e fraqueza muscular. O terceiro protocolo descreve um método de transferência de Fluorescência de Ressonância Energia (FRET) para avaliar mudanças na proximidade do AChRs adjacentes dentro das membranas pós-sinápticos ^14,15. Este método detecta transferência de energia entre AChRs vizinhos marcados com fluorescência-α-bungarotoxina (BGT). FRET ocorre apenas quando os doadores e aceitadores de sondas fluorescentes estão a menos de 10 nm de intervalo. Isso pode revelar alterações submicroscópicas () no aperto de embalagem AChR que podem se relacionam diretamente com a amplitude dos potenciais sinápticos.

Estes três protocolos, refinados ao longo da última década, fornecer medidas complementares a integridade NMJ de uma forma consistente e reproduzível. A utilização de protocolos padronizados dend parâmetros deve facilitar a comparação dos efeitos dos genes e intervenções ambientais sobre a JNM mamíferos.