신경 근육 접합 : 측정 시냅스 크기, 공 초점 형광 현미경을 사용하여 시냅스 단백질 농도의 분열 및 변경
Summary
The neuromuscular junction (NMJ) is altered in a variety of conditions that can sometimes culminate in synaptic failure. This report describes fluorescence microscope-based methods to quantify such structural changes.
Abstract
신경 근육 접합 (NMJ)은 포유 동물의 운동 신경이 자발적 근육 수축을 제어되는 큰, 콜린성 릴레이 시냅스이다. NMJ에서 구조 변경 약화, 위축과 근육 섬유의 사망을 초래, 신경 전달 오류가 발생할 수 있습니다. 많은 연구는 유전자 변형 또는 질환 마우스 NMJ의 구조를 변경할 수있는 방법을 연구 하였다. 불행히도, 직접들은 종종 다른 파라미터 분석 방법을 사용하기 때문에 이들 연구에서 조사 결과를 비교하기 어려울 수있다. 세 개의 프로토콜이 설명되어 있습니다. 제는 아세틸 콜린 수용체 (ACHR)의 면적을 측정하는 최대 강도 투영 공 촛점 이미지를 사용하여 단부 판과 상부 시냅스 전 신경 말단의 시냅스 소포 염색이 풍부한 영역에서 시냅스 막 도메인. 두 번째 프로토콜은 시냅스 막 시냅스 단백질에 대한 면역 염색의 상대적 강도를 비교합니다. 세 번째 홍보otocol은 엔드 플레이트에서 시냅스 AChRs의 포장의 변화를 감지하는 형광 공명 에너지 전달 (FRET)를 사용합니다. 프로토콜이 개발 및 일련의 연구를 통해 정제되었다. 품질과 결과의 일관성에 영향을 미치는 요인에 대해 설명하고 규범 적 데이터는 건강한 젊은 성인 마우스의 NMJs 제공됩니다.
Introduction
신경 근육 접합 (NMJ)는 신경계와 골격 근육 사이의 통신을 매개하는 중요한 릴레이 시냅스이다. 그것은 모든 자발적인 운동이 필요합니다. 형광 현미경 긴 NMJ 1-3 마우스 유전자의 효과를 연구하기 위해 또는 설치류 4-11 NMJs시 연령,식이 요법, 운동 및 질환의 효과를 비교하기 위해 사용되었다. 이러한 연구는 NMJ의 생리학 및 병리학 소개 훨씬 가르친하지만 다양한 매개 변수 (예, ACHR 영역 종판 영역, 경계 길이, 분열 인덱스)가 종종 어렵게 이들 연구의 결과를 비교할 수 있도록보고. 전임상 연구는 특히 질병 (12)의 설치류 모델 연구에서, 재현성을 입증 할 수 있으려면 증가 기대가있다. 여기에 설명 된 프로토콜은, 생리 학적 및 병태 생리 학적 발달 CH 조사 일련의 연구를 통해 정제시켰다NMJ에 ANGES. 이러한 연구는 마우스 모터 종판에서 시냅스 전문화 영역과 시냅스 전문화 13-15 시냅스 내의 단백질의 패킹의 상대 밀도의 측정을 필요로한다.
이 방법의 유용성은 중증 근무력증 안티 사향 마우스 모델에서 최근 연구에 의해 예시된다. 안티 사향 양성 중증에서의 IgG 매일 주사는 성인 마우스로 환자들을 2 주 (16) 내에서 약이 될 인한 근무력증. 근육 (신경 터미널에서) synaptophysin에 대한 이중 표지 된 섹션과 시냅스 AChRs의 공 초점 최대 프로젝션 이미지가 주 변화로 ACHR 염색 분야의 진보적 인 감소를 한 것으로 밝혀졌습니다. 감소의 중요한 비율은 시냅스 전위, 시냅스 전달 및 근육 약화 (17, 18)의 실패의 진폭에 비교 하락을 설명하기에 충분했다. 질적으로 비슷한 연구 결과는 다른 연구 그룹에 의해보고되었다10,19. NMJ 동일한 측정 방법은 사람이 마우스 모델 (20, 21)에 근무력증 안티 사향 중증의 치료 세 약물의 영향을 평가하기 위해 사용되어왔다.
정주의 노화는 신경 근육 연결의 손실을 초래할 수 있습니다. 마우스는 나이로 진행하면서 여기에 설명 된 프로토콜은 모터 종판에서 신경 터미널 시납의 영역에서 연령 관련 감소를 계시했다. 같은 방법은 자발적인 운동이 크게 다른 그룹 4로 이전의 연구와 일치하는 시냅스 전 신경 말단 영역 (22)의 감소를 방지 할 수있는 것으로 나타났습니다. 신경 근육 연결의 손실은 근 위축성 측삭 경화증 9,23의 SOD1G93A 마우스 모델에서 발생합니다.
상기 언급 된 연구들은 건강 상태의 다양한 NMJ에서 전후 시냅스 전문 하나의 영역에서 감소를 초래할 수 있음을 입증한다. 이것은 손상된 시냅스 재미가 발생할 수 있습니다ction의는 신경 근육 연결의 완전한 손실을 예고하거나. 세 가지 프로토콜은 지역과 시냅스 전문의 밀도의 정량을 허용하는 설명되어 있습니다. 제 1 프로토콜의 목적은 형광 현미경을 이용하여, 전후 및 포유 동물의 시냅스 전문 NMJs 그들의 배향의 영역의 실제적이고 재현 가능한 측정 값을 제공하는 것이다. 이차원 최대 투영 공 초점 이미지 및 NIH ImageJ에 함께 이미지 분석 시납 염색 (시냅스 소포), 시냅스 AChRs 시냅스 오버랩 영역의 면적의 변화를 감지하는 데 사용된다. 시냅스 전문 영역을 식별하는 데 사용되는 시각 정보를 최대화하기 위해 공 초점 촬상 파라미터 (이득 및 오프셋 레벨)이 각각 NMJ 최적화되어있다. 신경 근육 장애는 시냅스 ACHR 및 / 또는 기타 시냅스 단백질의 밀도의 변화로 발생할 수 있습니다. 제 2 프로토콜은 시냅스 단백질 등의 상대 밀도의 변화를 검출하도록 적용될 수있다사향, rapsyn, dystroglycan, 인산화의 Src 키나제 인산화 ACHR 18,21있다.
중증 근무력증에서 시냅스 막 내 ACHR의 감소 밀도는 시냅스 실패와 근육 약화의 직접적인 원인이다. 세 번째 프로토콜은 시냅스 막 (14, 15) 내에서 인접 AChRs의 근접의 변화를 평가하기 위해 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 방법을 설명합니다. 이 방법은 형광-α-bungarotoxin (BGT)으로 표시 이웃 AChRs 사이의 에너지 전달을 검출한다. 형광 기증자 및 수용체 프로브는 10nm 이하 떨어져있는 경우 FRET가 발생합니다. 이것은 직접 시냅스 전위의 진폭에 관련 될 수있다 ACHR 포장의 압박감에서 (초 현미경) 변경을 표시 할 수 있습니다.
지난 10 년 동안 정제 된이 세 가지 프로토콜은 일관되고 재현 가능한 방식으로 NMJ 무결성의 보완을 제공합니다. 표준화 된 프로토콜의 사용ND 파라미터 NMJ 포유류 유전자, 환경에 따라 중재 효과 비교를 용이하게한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된 프로토콜은 신뢰성있게 측정하고 정상 노화와 질병 상태를 포함한 조건의 범위에 걸쳐 NMJ의 특성의 변화를 정량화 할 수있게했다. EN에 대해 기재된 방법 NMJ 이미지 연구자 사전 및 시냅스 전문 분야의 오버랩 영역과 연접 / 배향의 면적과 비교 할 수 직면한다. 사전 및 시냅스 단백질 횡단 섹션을 사용하여 광 제 2 프로토콜의 상대 강도를 비교하기 위해 바람직하다. 세 번째 프로?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the National Health and Medical Research Council [570930]. Imaging was carried out at the Bosch Institute Advanced Microscopy Facility. Former members of the lab, whose work is cited, are thanked for their contributions to developing these methods.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Scanning confocal microscope | Leica | DM IRE2 with TCS SP2 system | Most scanning confocal microscopes should be suitable. |
| Zeiss | LSM 510 Meta | ||
| Leica | SPE-II | ||
| Alexa555-a-bungarotoxin (red-BGT) | Life technologies | B35451 | Used for labelling AChRs |
| Alexa647-α-bungarotoxin (far-red-BGT) | Life technologies | B35450 | Far red fluorescence: barely visible through the eyepiece |
| rabbit anti-synaptophysin | Life technologies | 18-0130 | Different batches of primary antibody differ in effective working dilution |
| FITC-anti-rapsyn mab1234 | Milipore | FCMAB134F | Monoclonal antibody conjugated to FITC |
| FITC-donkey anti-rabbit IgG | Jackson | 711-095-152 | Polyclonal secondary antibodies can vary in quality according to source and batch |
| Optimal Cutting Temperature compound (O.T.C.) | ProSciTech | IA018 | Cryostat embedding matrix for freezing muscles |
| DABCO | Sigma | 10981 | Mounting medium that slows photobleaching of fluorophors |
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