2D 전기 영동에 의한 대 식세포의 프로테옴 프로파일 링
Summary
Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.
Abstract
The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.
Introduction
대 식세포는 별개의 기능 표현형을 획득 할 수있는 이기종 및 플라스틱 세포이다. 생체 내,이 세포가 미생물 제품, 사이토 카인 등. 1과 마이크로 환경 signalssuch의 큰 다양성에 응답합니다. 시험관, 염증성 표현형 (M1) 대 식세포의 리포 폴리 사카 라이드 (LPS) 및 인터루킨 -4 (IL-4)와 같은 일부 사이토킨에 의해 항 염증 표현형 (M2)에 의해 유도 될 수있다. 또한, 대 식세포는 특정 신호 2에 따라, 반대로 M2 표현형에 활성화 된 M1에서 전환 할 수 있습니다.
표현형에 따라, 대 식세포는 다른 기능을해야합니다. M1 마크로파지는 미생물 또는 종양 세포 (3)를 죽이고, 종양 괴사 인자 α (TNF-α)와 같은 염증성 사이토 카인을 생산하는 세포이다. 반면, M2 식세포 안티 inflammator를 생성함으로써 상처 치유 및 섬유증과 같은 이러한 염증 반응을 방지3,4-을 TGF-β가 같은 Y 요인.
이전 Boyum 6에서 적응 기술을 사용하여 5 바와 같이 건강한 기증자로부터 인간의 말초 혈 단핵 세포를 피콜 밀도 구배 원심 분리에 의해 분리 하였다. 문화의 대 식세포는 차 문화 (7) 6 일 이후 M1 또는 M2 표현형로 분화 할 수있다.
단백질 발현 또는 숙주 병원성 미생물 또는 독소와 같은 다양한 제어되는 자극 하에서 식세포 두 아형 사이 단백질 변화 분석, 프로 및 소염 식세포의 기능을 해독하는데 도움이 될 것이다.
단백질 체학은 특히 업 또는 다양한 자극에 따라 인간 배양 된 대 식세포에서 아래로 조절되어 단백질의 직접 모니터링을위한 독특한 도구입니다. 형광 염료는 낮은 감도 및 이미지 분석 (8) 등의 2 차원 겔 전기 영동의 한계점을 해결 한 < / SUP>. 시스테인 잔기와 반응 염료는 리신 잔기 (9)와 반응에 비해 검출 감도가 증가하고있다. 이전의 연구에서는 고전 실버 염색 2 차원 전기 영동 (11)에 비해 부족한 시료 (10)의 분석을 위해 DIGE 포화 라벨링의 유용성을 입증 하였다. 이 기술은 빠른 속도로 대 식세포의 두 하위 유형 간 또는 동일한 하위 유형에서 치료 및 치료 대식 세포 사이의 단백질 변형을 분석하는 데 도움이됩니다.
이 단백질체 기술의 장점은 2D 겔 (12)을 분석하여 단백질의 크기 및 번역 후 변형의 정보에 대한 액세스를 가지고있다. 이 분석 될 수있는 샘플의 수를 제한하는, 이것이 높은 처리량 기법 아니다 고려되어야한다. 질량 분석을 기반으로 높은 처리량 분석의 개발 검토로는 최근에 13이을 향상시킬 수 있습니다.
_content "> 여기에서는 전기 영동 isoelectrofocusing의 과정을 통해 배양 된 대 식세포의 단백질 추출에서 2D DIGE 분석을 수행하는 방법을 제시하고, 적절한 2D 소프트웨어의 유용성에 대한 SDS-PAGE 정보뿐만 아니라.Protocol
Representative Results
Discussion
본원에 기재된 프로토콜은 식세포, M1 (염증 유발)와 M2 (소염)의 두 아형의 다양한 자극의 영향을 분석하는 방법을 자세히. 이전에 7을 발표 한 M1과 M2 대 식세포의 차 문화는 단핵구의 분화에서 얻었다.
2D DIGE 겔 전기 영동 과정은를 Cy3 및 Cy5의 형광 용 스캐너 여기 / 발광 파장 두배 겔을 검사하기 위하여 SDS-PAGE 용 isoelectrofocusing 낮은 형광 플레이트 IEF 셀 같은 특수 재?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Inserm. Marion Bouvet is a fellow of the French Ministry for Research and Technology. Annie Turkieh is a fellow granted by European Union FP7 HOMAGE (305507).
Materials
| Name | Company | Catalog number |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 31870-074 |
| PBX 10 X | Invitrogen | 14200-083 |
| L-glutamine-200mM-100X | Invitrogen | 25030-024 |
| gentamycin 10 mg/mL | Invitrogen | 15710-049 |
| human serum | Invitrogen | 34005100 |
| Ficoll d=1,077 | ATGC | L6115 |
| Leucosep | Dutscher | 16760 |
| 6-wells plate PRIMARIA | Becton Dickinson | 353846 |
| IL-4 | Promocell | B-61410 |
| lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L-2654 |
| Giemsa | Fluka | 48900 |
| EDTA MM372,2 | Research Organics | 3.00E+01 |
| Filter 0,22µm | Millipore | SCGPTORE |
| 100 mL cylinder | Corning | 430182 |
| TCEP | Interchim | UP242214 |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 |
| Cy3+Cy5-reactive dye | GE Healthcare | 25-8009-83 |
| IPG strip 3-10 24cm | GE Healthcare | 17-6002-44 |
| Protean IEF cell | Bio-Rad | 165-4000 |
| Low-melting agarose | Invitrogen | 15517-014 |
| Ettan-Daltsix system | GE Healthcare | 80-6485-08 |
| Ettan DIGE Imager scanner | GE Healthcare | |
| Progenesis Samespot | Non linear dynamics | |
| 50 ml tubes | any supplier | n/a |
| 15 ml tubes | any supplier | n/a |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C5070 |
| Urée | Merk | 108484-500 |
| Thiourée | Sigma-Aldrich | T7875 |
| DTT | Bio-Rad | 1610611 |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678 |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T3253 |
| Pharmalytes 3-10 | GE Healthcare | 17-0456-01 |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3773 |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 |
| Acrylamide 40% | Bio-Rad | 161-0148 |
| 2D clean Up | GE Healthcare | 80-6454-51 |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 |
| Diméthylformamide | Sigma-Aldrich | 22705-6 |
| electrode wicks | Bio-Rad | 165-4071 |
Referências
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