Proteomics Profilering van macrofagen door 2D-elektroforese
Summary
Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.
Abstract
The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.
Introduction
Macrofagen zijn heterogeen en plastic cellen die kunnen verschillende functionele fenotypes verwerven. In vivo, deze cellen reageren op een grote verscheidenheid aan micro milieu signalssuch microbiële producten, cytokines, etc. 1. In vitro, de pro-inflammatoire fenotype (M1) macrofagen kunnen worden geïnduceerd door lipopolysaccharide (LPS) en de anti-inflammatoire fenotype (M2) van bepaalde cytokines zoals interleukine-4 (IL-4). Bovendien kunnen macrofagen schakelen van een geactiveerde M1 M2 fenotype, en omgekeerd, op specifieke signalen 2.
Afhankelijk van het fenotype, zal macrofagen verschillende functies. M1 macrofagen cellen die pro-inflammatoire cytokines zoals tumor necrose factor α (TNF-α) produceren, micro-organismen of tumorcellen 3 doden. Daarentegen M2 macrofagen voorkomen dat deze ontstekingsreactie zoals in wondgenezing en fibrose van die anti-inflammatory factoren zoals TGF-β 3,4.
Humane perifere bloed mononucleaire cellen van gezonde donoren werden geïsoleerd door Ficoll dichtheidsgradiënt centrifugatie zoals eerder beschreven 5 met een techniek aangepast van Boyum 6. Macrofagen in cultuur kan worden onderscheiden in M1 of M2 fenotype na 6 dagen van de primaire cultuur 7.
Analyse van eiwitexpressie of eiwit bij de twee subtypes van macrofagen bij verschillende gecontroleerde stimuli, zoals gastheer pathogeniteit of microbiële toxinen, zal nuttig zijn om de functionaliteit van de pro- en anti-inflammatoire macrofagen ontcijferen.
Proteomics zijn unieke instrumenten voor directe controle van eiwitten die specifiek up- of down-gereguleerd in menselijke gekweekte macrofagen onder verschillende stimuli. Fluorescerende kleurstoffen opgelost aantal beperkingen van 2D gel elektroforese, zoals lage gevoeligheid en beeldanalyse 8 < / Sup>. De kleurstoffen reactie met cysteïne residuen de detectiegevoeligheid vergeleken met die reageren met lysineresten 9 verhoogd. In een eerdere studie hebben we aangetoond dat de bruikbaarheid van DIGE verzadiging etikettering van de analyse van schaarse monsters 10 met de klassieke zilvergevlekte 2D electroforese 11. Deze techniek is nuttig bij het snel analyseren eiwitmodificaties tussen de twee subtypes van macrofagen of tussen onbehandelde en behandelde macrofagen uit hetzelfde subtype.
De voordelen van deze techniek zijn proteomische toegang tot de informatie van eiwitgrootte en post-translationele modificaties die door analyse van de 2D gel 12. Er moet rekening mee dat dit geen hoge doorvoer techniek worden gehouden, waardoor het aantal monsters dat kan worden geanalyseerd. De ontwikkeling van high throughput assays op basis van massaspectrometrie als beoordeeld onlangs 13 kan dit verbeteren.
_content "> Hier presenteren we hoe 2D DIGE analyse van het eiwit extractie van gekweekte macrofagen te voeren door middel van de processen van elektroforese, isoelectrofocusing, en SDS-PAGE, evenals informatie over het nut van adequate 2D software.Protocol
Representative Results
Discussion
De hierin beschreven protocol Gegevens methode om de invloed van verschillende stimuli van de twee subtypes van macrofagen, M1 (pro-inflammatoire) en M2 (anti-inflammatoire) geanalyseerd. Primaire, M1 en M2 macrofagen werden verkregen van de differentiatie van monocyten als eerder gepubliceerd 7.
De procedure van 2D DIGE gelelektroforese speciale materialen en uitrusting, zoals IEF cel isoelectrofocusing lage fluorescentie platen voor de SDS-PAGE om tweemaal de gel bij excitatie /…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Inserm. Marion Bouvet is a fellow of the French Ministry for Research and Technology. Annie Turkieh is a fellow granted by European Union FP7 HOMAGE (305507).
Materials
| Name | Company | Catalog number |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 31870-074 |
| PBX 10 X | Invitrogen | 14200-083 |
| L-glutamine-200mM-100X | Invitrogen | 25030-024 |
| gentamycin 10 mg/mL | Invitrogen | 15710-049 |
| human serum | Invitrogen | 34005100 |
| Ficoll d=1,077 | ATGC | L6115 |
| Leucosep | Dutscher | 16760 |
| 6-wells plate PRIMARIA | Becton Dickinson | 353846 |
| IL-4 | Promocell | B-61410 |
| lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L-2654 |
| Giemsa | Fluka | 48900 |
| EDTA MM372,2 | Research Organics | 3.00E+01 |
| Filter 0,22µm | Millipore | SCGPTORE |
| 100 mL cylinder | Corning | 430182 |
| TCEP | Interchim | UP242214 |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 |
| Cy3+Cy5-reactive dye | GE Healthcare | 25-8009-83 |
| IPG strip 3-10 24cm | GE Healthcare | 17-6002-44 |
| Protean IEF cell | Bio-Rad | 165-4000 |
| Low-melting agarose | Invitrogen | 15517-014 |
| Ettan-Daltsix system | GE Healthcare | 80-6485-08 |
| Ettan DIGE Imager scanner | GE Healthcare | |
| Progenesis Samespot | Non linear dynamics | |
| 50 ml tubes | any supplier | n/a |
| 15 ml tubes | any supplier | n/a |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C5070 |
| Urée | Merk | 108484-500 |
| Thiourée | Sigma-Aldrich | T7875 |
| DTT | Bio-Rad | 1610611 |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678 |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T3253 |
| Pharmalytes 3-10 | GE Healthcare | 17-0456-01 |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3773 |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 |
| Acrylamide 40% | Bio-Rad | 161-0148 |
| 2D clean Up | GE Healthcare | 80-6454-51 |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 |
| Diméthylformamide | Sigma-Aldrich | 22705-6 |
| electrode wicks | Bio-Rad | 165-4071 |
Referências
- van Ginderachter, J. A., et al. Classical and alternative activation of mononuclear phagocytes: picking the best of both worlds for tumor promotion. Immunobiology. 211, (2006).
- Porcheray, F., et al. Macrophage activation switching: an asset for the resolution of inflammation. Clin. Exp. Immunol. 142, 481-489 (2005).
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
- Mantovani, A., Locati, M., Vecchi, A., Sozzani, S., Allavena, P. Decoy receptors: a strategy to regulate inflammatory cytokines and chemokines. Trends Immunol. 22, 328-336 (2001).
- Pinet, F., et al. Morphology, homogeneity and functionality of human monocytes-derived macrophages. Cell. Mol. Biol. 49, 899-905 (2003).
- Boyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1. 97, 77-89 (1968).
- Chinetti-Gbaguidi, G., et al. Human atherosclerotic plaque alternative macrophages display low cholesterol handling but high phagocytosis because of distinct activities of the PPARγ and LXRα pathways. Circ. Res. 108, 985-995 (2011).
- Tonge, R., et al. Validation and development of fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis proteomics technology. Proteomics. 1, 377-396 (2001).
- Shaw, J., et al. Evaluation of saturation labelling two-dimensional difference gel electrophoresis fluorescent dyes. Proteomics. 3, 1181-1195 (2003).
- Dupont, A., et al. Application of saturation dye 2D DIGE proteomics to characterize proteins modulated by oxidized low density lipoprotein treatment of human macrophages. J. Proteome Res. 7, 3572-3582 (2008).
- Dupont, A., et al. Two-dimensional maps and databases of the human macrophage proteome and secretome. Proteomics. 4, 1761-1778 (2004).
- Acosta-Martin, A. E., et al. Impact of incomplete DNase I treatment on human macrophage analysis. Proteomics Clin. Appl. 3, 1236-1246 (2009).
- Acosta-Martin, A. E., Lane, L. Combining bioinformatics and MS-based proteomics: clinical implications. Expert Rev Proteomics. , (2014).
- Boytard, L., et al. Role of proinflammatory CD68+MR- macrophages in peroxiredoxin-1 expression and in abdominal aortic aneurysms in humans. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 33, 431-438 (2013).
