Summary

Todo el montaje de imágenes de embriones de ratón Proyecciones sensorial Axon

Published: December 09, 2014
doi:

Summary

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

Abstract

La visualización de proyecciones neuronales de larga duración en los embriones es esencial para obtener una comprensión de cómo los mamíferos desarrollan redes neuronales. Aquí se describe un método para etiquetar in situ un subconjunto de ganglios de la raíz dorsal (GRD) proyecciones axón para evaluar sus características fenotípicas utilizando varias líneas de ratones manipulados genéticamente. Las neuronas TrkA-positivo son las neuronas nociceptivas, dedicada a la transmisión de señales de dolor. Utilizamos una línea de ratones TrkA taulacZ para etiquetar las trayectorias de todos los axones periféricos TrkA-positivo en el embrión de ratón intacto. Criamos aún más la línea TrkA taulacZ sobre un fondo nulo Bax, que esencialmente suprime la apoptosis neuronal, a fin de evaluar las preguntas relacionadas con el crecimiento independientemente de los posibles efectos de las manipulaciones genéticas sobre la supervivencia neuronal. Posteriormente, los ratones modificados genéticamente de interés son criados con el TrkA TaullacZ / Bax línea nula y son entonces listo para su estudio usando las técnicas descritas en el presente documento. Esta presentación incluye información detallada sobre los planes de cría de ratón, genotipificación en el momento de la disección, la preparación del tejido, la coloración y el desmonte para permitir la visualización de larga duración trayectorias axonal en la preparación de todo el montaje.

Introduction

Establecimiento de redes neuronales precisos es un complejo proceso de desarrollo esencial para la funcionalidad del sistema nervioso. Perturbación en este proceso conduce a la disfunción neuronal que ha sido implicado en enfermedades neurológicas humanas 1-3. Para estudiar los mecanismos moleculares subyacentes de crecimiento de los axones y la inervación diana en mamíferos, hemos desarrollado un protocolo para visualizar las trayectorias axonales de TrkA-expresión de las neuronas sensoriales usando una combinación de dos líneas de ratones modificados genéticamente.

TrkA es un receptor para el factor de crecimiento nervioso NGF y es un marcador funcional de las neuronas sensoriales nociceptivas 4. TrkA es altamente expresado en las neuronas nociceptivas durante el desarrollo temprano y media la supervivencia de neuronas dependientes de NGF, el crecimiento axonal, la arborización y el objetivo inervación 5-9. En los ratones TrkA taulacZ, el gen TrkA de tipo salvaje se sustituye por una expresión taulacZ cassette 10, de tal manera que la morfología axonal de las neuronas TrkA-positivos putativos se puede visualizar por β-gal (X-gal) tinción 11. Mediante una línea de TrkA taulacZ / WT heterocigóticos, podemos examinar los factores que pueden regular o interferir con el desarrollo de proyecciones aferentes sensoriales en vivo.

Por otra parte, la expresión de TrkA está ausente en ratones homocigotos TrkA taulacZ / taulacZ, que por lo tanto pueden ser utilizados para evaluar el crecimiento del axón promoción de mecanismos en la ausencia de la señalización de NGF / TrkA. Dado que las neuronas nociceptivas dependen de NGF / TrkA señalización no sólo para el crecimiento axonal, sino también para la supervivencia, empleamos otra línea de ratones, que carecen del gen Bax pro-apoptóticos, para inhibir la apoptosis en las neuronas DRG embrionarias, rescatar de la muerte celular que es lo contrario observado en ausencia de la señalización de TrkA. El Bax – / – fondo 12 por lo tanto permite la molecudisección lar de las vías de señalización que afectan específicamente axón 7-9,13-15 crecimiento. En TrkA – / -: Bax – / – ratones, DRG neuronas sobreviven, pero inervación aferente sensorial en la piel es la supresión total de 14,15. Podemos activar selectivamente las vías de señalización para determinar sus respectivas contribuciones al desarrollo de las proyecciones de los axones. La utilidad de este método es que permite la evaluación de los cambios en los fenotipos de crecimiento axonal cuando diferentes modificaciones genéticas se crían en el TrkA taulacZ / taulacZ: Bax – / – o TrkA taulacZ / WT: Bax – / – fondos.

Protocol

NOTA: Todos los procedimientos se ajusten a la Guía del NIH para el uso y cuidado de animales de laboratorio. El animal protocolo fue aprobado por el IACUC en el Weill Cornell Medical College. 1. Preparación del tejido La eutanasia hembras cronometrada del embarazo por dislocación cervical 15. Diseccionar embrionarias E16 – E18 embriones de las hembras cronometrada del embarazo y colocar los embriones individualmente en los pocillos de una placa de 6 pocillos, llenos…

Representative Results

Los genotipos de TrkA WT / taulacZ: Bax – / – y TrkA taulacZ / taulacZ: Bax – / – embriones se pueden determinar de forma inequívoca por genotipo PCR estándar (Figura 1). Tinción pantallas X-gal detallan cenadores axonales periféricos por vía subcutánea en embriones convencionalmente manchadas (Figuras 2, 3a), y en todo el embrión después de la compensación de tejido (Figuras 3b, 4). Hemos…

Discussion

El procedimiento de tinción X-gal-descrita anteriormente de ratones embrionarios TrkA taulacZ permite la visualización rápida y detallada de las proyecciones de los axones de larga distancia en el embrión intacto fijo. Debido a la nula fondo Bax estos ratones permiten el sondaje de los mecanismos que pueden contribuir tanto al crecimiento del axón neuronal y la supervivencia de señalización. El apareamiento con transgénicos o knockout ratones de interés permite una evaluación compl…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores desean agradecer al Dr. Louis Reichardt para los ratones TrkA taulacZ y Dr. Annette Markus para el debate profundo y sugerencias. Este trabajo fue apoyado por fondos de puesta en marcha de la Fundación Burke, así como la Fundación Whitehall beca de investigación 2010-08-61, una beca de investigación de Wings for Life Foundation (WFL-US-028/14), conceder ZB1-1102-1 del Christopher & Dana Reeve Foundation, y subvenciones 1R01EY022409 y 3R01EY022409-01S1 del Instituto Nacional del Ojo, a JZ. KJO es un compañero de Goldsmith.

Materials

Company Catalog Number
PFA Sigma-Aldrich P6418
PBS Life Tech 10010-023
Tissue Rinse Solution A Millipore BG-6-B
Tissue Rinse Solution B Millipore BG-7-B
Tissue Stain Base Solution Millipore BG-8-C
X-gal  Sigma-Aldrich B4252
Glass scintiallation vial Kimble Chase 74500-20
Incubator Labline Model 120
Insect pins FST 26000-30
DMSO Sigma-Aldrich D8418
6 well dish USA Scientific CC7672-7506
Primers IDT custom DNA primers
Takara dNTP mixture Takara 4030
Takara LA buffer Takara RR002A
Takara LA Taq Takara RR002A
PCR machine Bio-Rad  DNA Engine Dyad
Benzyl alcohol Sigma-Aldrich B-1042
Benzyl benzoate Sigma-Aldrich B-6630
Dissecting microscope Leica M205A
Camera Leica DFC310FX
Ring light  Leica  MEB110
Photoshop Adobe Photoshop 4.0

Referências

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Citar este artigo
O’Donovan, K. J., O’Keeffe, C., Zhong, J. Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections. J. Vis. Exp. (94), e52212, doi:10.3791/52212 (2014).

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