הדמיה הר-כל תחזיות החושיות אקסון העובר העכבר
Summary
We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.
Abstract
ההדמיה של תחזיות עצביות באורך מלא בעוברים היא חיונית כדי לזכות בהבנה של איך יונקים רשתות עצביות לפתח. כאן אנו מתארים שיטה לתייג באתר משנה של גנגליון שורש הגבי תחזיות האקסון (DRG) כדי להעריך את המאפיינים פנוטיפי שלהם באמצעות כמה שורות עכבר מניפולציות גנטית. נוירונים TrkA חיובי נוירונים קולטן אזעקה, שהוקדשו להעברת אותות כאב. אנו מנצלים קו עכבר TrkA taulacZ לתייג המסלולים של כל האקסונים ההיקפיים TrkA החיובי בעובר העכבר ללא פגע. בנוסף, אנו להתרבות קו TrkA taulacZ על רקע null Bax, אשר למעשה מבטל אפופטוזיס העצבי, על מנת להעריך את השאלות הקשורות לצמיחה באופן עצמאי מהשפעות אפשריות של מניפולציות גנטיות על הישרדות עצבית. בהמשך לכך, עכברים מהונדסים גנטי של עניין הם התרבו עם taul TrkAקו וnull acZ / Bax אז הם מוכנים למחקר באמצעות הטכניקות המתוארות במסמך זה. מצגת זו כוללת מידע מפורט על תוכניות רבייה עכבר, genotyping בזמן הנתיחה, הכנת רקמה, צביעה וסליקה, כדי לאפשר ויזואליזציה של מסלולי axonal באורך מלא בהכנה כל הר.
Introduction
הקמת רשתות עצביות מדויקות היא תהליך התפתחותי מורכב חיוני לפעולה התקינה של מערכת העצבים. הפרעה בתהליך זה מובילה לבעיות בתפקוד עצביים שהיה מעורב במחלות נוירולוגיות אנושיות 1-3. כדי לחקור את המנגנונים מולקולריים שבבסיס של צמיחת האקסון ועצבוב היעד ביונקים, שפיתחנו פרוטוקול לדמיין מסלולי axonal של TrkA להביע עצב סנסורי באמצעות שילוב של שני קווי עכבר מהונדסים גנטי.
TrkA הוא קולטן לגורם גדילה עצבית NGF ומהווה סמן תפקודי של עצב סנסורי nociceptive 4. TrkA מתבטא מאוד בתאי עצב nociceptive במהלך התפתחות מוקדמת ומתווך הישרדות NGF תלוי נוירון, צמיחת האקסון, arborization ויעד עצבוב 5-9. בעכברי TrkA taulacZ, גן TrkA הסוג בר הוא הוחלף על ידי ג ביטוי taulacZ10 assette, כך שמורפולוגיה axonal של נוירונים TrkA החיובי משוערים ניתן דמיינה ידי β-gal (X-gal) מכתים 11. באמצעות קו TrkA taulacZ / WT הטרוזיגוטיים, אנו יכולים לבחון גורמים שעשויים לווסת או להפריע להתפתחות של תחזיות מביא חושיות in vivo.
יתר על כן, ביטוי TrkA נעדר בעכברי TrkA taulacZ / taulacZ הומוזיגוטים, אשר על כן ניתן להשתמש בו כדי להעריך את צמיחת האקסון קידום מנגנונים בהעדר איתות NGF / TrkA. מאז הנוירונים nociceptive תלויים בNGF / TrkA איתות לא רק לצמיחת האקסון, אלא גם להישרדות, אנו מעסיקים קו עכבר אחר, חסר את גן Bax פרו-אפופטוטיים, לעכב אפופטוזיס בתאי עצב DRG עוברי, מציל אותם ממוות של תאים שהוא אחרת נצפה בהעדר איתות TrkA. Bax – / – הרקע 12 וכך מאפשר לmolecuנתיחת lar של מסלולי איתות שדווקא משפיעים 7-9,13-15 צמיחת האקסון. בTrkA – / -: Bax – / – עכברים, תאי עצב DRG לשרוד, אבל עצבוב מביא חושי בעור הוא בוטל לחלוטין 14,15. אנחנו באופן סלקטיבי יכולים להפעיל מסלולי איתות כדי לקבוע התרומות שלהם לפיתוח תחזיות האקסון. השירות של שיטה זו הוא שהיא מאפשרת ההערכה של שינויים בפנוטיפים צמיחת axonal כאשר שינויים גנטיים שונים הם התרבו על TrkA taulacZ / taulacZ: Bax – / – או TrkA taulacZ / WT: Bax – / – רקע.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההליך מכתים X-gal-שתואר לעיל של עכברי TrkA taulacZ עובריים מאפשר ההדמיה המהירה ומפורטת של תחזיות האקסון למרחקים ארוכים בעובר הקבוע בשלמותה. בגלל רקע null Bax עכברים אלה מאפשרים לחיטוט של איתות מנגנונים שעשויות לתרום לצמיחת שני האקסון והישרדות עצבית. הזדווגות עם…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לד"ר לואיס Reichardt לעכברי TrkA taulacZ וד"ר אנט מרקוס לדיון והצעות תובנה. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות הפעלה מהקרן בורק כמו גם המענק וייטהול קרן מחקר 2010-08-61, מענק מחקר מכנפיים לקרן חיים (WFL-ארה"ב-028/14), להעניק ZB1-1102-1 מ כריסטופר ודנתי ריב קרן, ומענקים 1R01EY022409 ו3R01EY022409-01S1 מהעין הלאומית, לJZ. KJO הוא עמית גולדסמית.
Materials
| Company | Catalog Number | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6418 |
| PBS | Life Tech | 10010-023 |
| Tissue Rinse Solution A | Millipore | BG-6-B |
| Tissue Rinse Solution B | Millipore | BG-7-B |
| Tissue Stain Base Solution | Millipore | BG-8-C |
| X-gal | Sigma-Aldrich | B4252 |
| Glass scintiallation vial | Kimble Chase | 74500-20 |
| Incubator | Labline | Model 120 |
| Insect pins | FST | 26000-30 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 |
| 6 well dish | USA Scientific | CC7672-7506 |
| Primers | IDT | custom DNA primers |
| Takara dNTP mixture | Takara | 4030 |
| Takara LA buffer | Takara | RR002A |
| Takara LA Taq | Takara | RR002A |
| PCR machine | Bio-Rad | DNA Engine Dyad |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | B-1042 |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B-6630 |
| Dissecting microscope | Leica | M205A |
| Camera | Leica | DFC310FX |
| Ring light | Leica | MEB110 |
| Photoshop | Adobe | Photoshop 4.0 |
Referências
- Verze, L., et al. Cutaneous innervation in hereditary sensory and autonomic neuropathy type IV. Neurology. 55, 126-128 (2000).
- Sethna, N. F., Meier, P. M., Zurakowski, D., Berde, C. B. Cutaneous sensory abnormalities in children and adolescents with complex regional pain syndromes. Pain. 131, 153-161 (2007).
- Uceyler, N., et al. Small fibers in Fabry disease: baseline and follow-up data under enzyme replacement therapy. J Peripher Nerv Syst. 16, 304-314 (2011).
- Reichardt, L. F., Mobley, W. C. Going the distance, or not, with neurotrophin signals. Cell. 118, 141-143 (2004).
- White, F. A., et al. Synchronous onset of NGF and TrkA survival dependence in developing dorsal root ganglia. J Neurosci. 16, 4662-4672 (1996).
- Farinas, I., Wilkinson, G. A., Backus, C., Reichardt, L. F., Patapoutian, A. Characterization of neurotrophin and Trk receptor functions in developing sensory ganglia: direct NT-3 activation of TrkB neurons in vivo. Neuron. 21, 325-334 (1998).
- Markus, A., Zhong, J., Snider, W. D. Raf and akt mediate distinct aspects of sensory axon growth. Neuron. 35, 65-76 (2002).
- Kuruvilla, R., et al. A neurotrophin signaling cascade coordinates sympathetic neuron development through differential control of TrkA trafficking and retrograde signaling. Cell. 118, 243-255 (2004).
- Zhong, J., et al. Raf kinase signaling functions in sensory neuron differentiation and axon growth in vivo. Nature. 10, 598-607 (2007).
- Bulfone, A., et al. An olfactory sensory map develops in the absence of normal projection neurons or GABAergic interneurons. Neuron. 21, 1273-1282 (1998).
- Moqrich, A., et al. Expressing TrkC from the TrkA locus causes a subset of dorsal root ganglia neurons to switch fate. Nature. 7, 812-818 (2004).
- Knudson, C. M., Tung, K. S., Tourtellotte, W. G., Brown, G. A., Korsmeyer, S. J. Bax-deficient mice with lymphoid hyperplasia and male germ cell death. Science. 270 (5233), 96-99 (1995).
- Lentz, S. I., Knudson, C. M., Korsmeyer, S. J., Snider, W. D. Neurotrophins support the development of diverse sensory axon morphologies. J. Neurosci. 19, 1038-1048 (1999).
- Patel, T. D., Jackman, A., Rice, F. L., Kucera, J., Snider, W. D. Development of sensory neurons in the absence of NGF/TrkA signaling in vivo. Neuron. 25, 345-357 (2000).
- Donovan, K. J., et al. B-RAF kinase drives developmental axon growth and promotes axon regeneration in the injured mature CNS. The Journal of experimental medicine. 211, 801-814 (2014).
- Mercer, K., et al. Expression of endogenous oncogenic V600EB-raf induces proliferation and developmental defects in mice and transformation of primary fibroblasts. Cancer research. 65, 11493-11500 (2005).
- Tronche, F., et al. Disruption of the glucocorticoid receptor gene in the nervous system results in reduced anxiety. Nature genetics. 23, 99-103 (1999).
- Madisen, L., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nat Neurosci. 15, 793-802 (2012).
- Feng, G., et al. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Schmidt, H., Rathjen, F. G. DiI-labeling of DRG neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord. J Vis Exp. , (2011).
