Periyodik Asit Schiff Boyama ile periferik kan mononükleer hücreleri glikojen algılama
Summary
Periodic acid Schiff staining is a technique that visualizes the polysaccharide content of tissues. This article demonstrates periodic acid Schiff staining protocol adapted for use on peripheral blood mononuclear cells purified from human venous blood. Such samples are enriched for lymphocytes and other white blood cells of the immune system.
Abstract
Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. Polysaccharides such as glycogen, glycoproteins, and glycolipids stain bright magenta making it easy to enumerate positive and negative cells within the tissue. In muscle cells PAS staining is used to determine the glycogen content in different types of muscle cells, while in blood cell samples PAS staining has been explored as a diagnostic tool for a variety of conditions. Blood contains a proportion of white blood cells that belong to the immune system. The notion that cells of the immune system possess glycogen and use it as an energy source has not been widely explored. Here, we describe an adapted version of the PAS staining protocol that can be applied on peripheral blood mononuclear immune cells from human venous blood. Small cells with PAS-positive granules and larger cells with diffuse PAS staining were observed. Treatment of samples with amylase abrogates these patterns confirming the specificity of the stain. An alternate technique based on enzymatic digestion confirmed the presence and amount of glycogen in the samples. This protocol is useful for hematologists or immunologists studying polysaccharide content in blood-derived lymphocytes.
Introduction
Periyodik asit Schiff (PAS) boyama yaygın kas araştırma ve teşhis kullanılan bir immunohistokimyasal tekniktir. Aynı zamanda kan örnekleri üzerinde bir teşhis aracı olarak kullanılır. tekniği renksiz Schiff reaktifi böylece derin bir kırmızı ürünü üreten tepki polisakkarit oluşturarak aldehit grupları içinde birimler okside numune, periyodik asit çözeltisi uygulayarak çalışır. Bu işlem aşamaları, Şekil 1 'de gösterilmiştir. leke glikojen, glikoproteinler, glikolipidler, müsin veya polisakarit parçası ile diğer moleküller de dahil olmak üzere polisakaritler, kırmızı, herhangi bir şey döner.
PAS boyama, genellikle kas lifleri glikojen seviyelerini ölçmek için kullanılır. Kaslar doku bölümleri onlar sıkıca slayt eklemek ve çoklu yıkama ve boyama aşamaları dayanacak gibi tekniği için idealdir. Glikojen yüksek bir talep var Tip II kas lifleri, hızlı seğirme en mevcutMaksimum performans için 1,2 glikojen gerektiren hızlı ATP üretimi için. Glikojen glikojen fosforilaz enzimlerinin hareketiyle serbest glukoz ayrılabilir bir glikoz dallı bir polimerdir. Dinlenme ve beslenme yeterliliği zamanlarda, glikojen, glikojen depo sürecinde doldurulan ise beslenme yetersizliği veya yüksek-enerji talebi zamanlarında; glikojen glikojenoliz tarafından glikoz bölünür. Kan örneklerinde olduğu gibi erken 1950 en klinisyen bilim adamları araştırdı gibi PAS boyama çeşitli hastalıklarda 3-7 glikojen içeriğini analiz etmek. Örneğin, Pompe hastalığı bir bonafide glikojen depolama hastalıksız beyaz kan hücreleri sağlıklı kontrollerden 8 önemli ölçüde farklıdır glikojen büyük miktarlarda birikir.
Bu video-madde periferal kan tek-çekirdekli hücrelerinin (PBMC) sağlıklı bir insan deneklerin venöz kan numuneleri kullanmak için PAS boyanması uyarlanmış bir versiyonunu gösterir. PBMCs örneğin doğal katil hücreler ve monositler gibi T lenfosit ve B lenfosit ailesine ve diğer bağışıklık hücrelerinin, çoğunlukla lenfositler içerir. İlk saflaştırma adımı, eritrositleri, nötrofiller ve diğer granülositler kaldırır. Bu teknik, tam kan smear ile karşılaştırıldığında PAS pozitif hücrelerin daha güçlü sayımı için izin lenfositlerin konsantre oranı ilgili verileri sağlar.
Şekil 1:. PBMC PAS boyama aşaması yöntem vasıtasıyla, aşama (a) İlk olarak, PBMC izole Ficoll gradyanı ile elde edilir, Sol panel, santrifüj işleminden önce hazırlanışını göstermektedir, sağ panel santrifüj sonra gösterilmekte olup, burada PBMC içeren ince beyaz tabaka tüpün merkezinde görülmektedir. (B) izole edilmiş PBMC, formalinle etanol sabitleyici Solu kullanılarak slayt üzerine sabitleniryon. Slayt hafifçe plastik bir yıkama şişesinden damıtılmış su ile iyice durulanır. (C), Lam, daha sonra glikojen eriyecektir amilaz çözeltisi ile doldurulmuş 100 ml'lik bir beher yarım, yerleştirilir. Slayt hafifçe çalkalanır. (D) slayt sakarit oksidasyon meydana periyodik asit çözeltisi ile muamele edilir. Slaytlar hafifçe durulanır; bu fazla periyodik asit çıkarın ve oksidasyon aşamasını durur. (E) Schiff reaktif slaytlara eklendi, bu oksitleme adımı sırasında oluşturulan aldehit ile reaksiyona girer. Bu, renksiz bir reaktif maddesi daha sonra, bir koyu kırmızı eflatun bir ürün ile sonuçlanır. Slaytlar hafifçe fazla Schiff reaktifi kaldırmak için durulanır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu video makalede kritik adım hücrelerin yıkanması ve amilaz işlemi sırasında idi. Slaytlar yıkarken önemli bir adım bir plastik sıkılabilir yıkama şişesi kullanarak ve su yavaşça slayt üzerinde numune üzerinden çalıştırmak izin ve örneklerin doğrudan hedefleyen değildi. Hatta ufak doğrudan su basıncı slayt dökülmek hücreleri neden olur. Bir başka önemli adım ± amilaz koşulları için aynı slayt kullanmak oldu. PBMC slayta yapıştırılmış sonra, dikkatli bir şekilde kayar, böy…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by a grant from the NSERC Discovery program grant number RGPIN 418522-2013. We thank R. Kilgour for helpful discussions, and Katelin Gresty and Dr. A. Berghdal for providing the mouse muscle sections.
Materials
| Periodic Acid Shiff Kit | Sigma-Aldrich | 395B | Bring to room temperature prior to use. Materials in this kit are toxic and harmful. Use caution http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/395b?lang=en®ion=CA |
| α-Amylase from porcine pancreas | Sigma-Aldrich | A3176 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a3176?lang=en®ion=CA |
| Binocular Microscope | Carl Zeiss Microscopy | Axio Lab A0 | |
| Glycogen Assay Kit | Sigma-Aldrich | MAK016 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/mak016?lang=en®ion=CA |
| Ficoll-Paque PLUS | VWR, GE Healthcare | 17-1440-02 | Nonionic synthetic polymer of sucrose https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4779441 |
| Centrifuge | For PBMC isolation, swing buckets were used |
Referências
- Rich, P. R. The molecular machinery of keilin’s respiratory chain. Biochem. Soc. Trans. 31 (Pt 6), 1095-1105 (2003).
- Peter, J. B., Barnard, R. J., Edgerton, V. R., Gillespie, C. A., Stempel, K. E. Metabolic profiles of three fiber types of skeletal muscle in guinea pigs and rabbits). Bioquímica. 11 (14), 2627-2633 (1972).
- Jones, R. V., Goffi, G. P., Hutt, M. S. R. Lymphocyte glycogen content in various disease. J. Clin. Pathol. 15 (1), 36-39 (1962).
- Scott, R. B. Glycogen in human peripheral blood leukocytes. I. characteristics of the synthesis and turnover of glycogen in vitro. J. Clin. Invest. 47 (2), 344-352 (1968).
- Fedele, D., et al. positive index of lymphocytes and metabolic control in insulin-treated and type II diabetes mellitus. Diabete Metab. 9 (3), 188-192 (1983).
- Brelińska-Peczalska, R., Mackiewicz, S. Cytochemical studies of peripheral blood granulocytes and lymphocytes in patients with systemic lupus erythematosus. Pol.Med.Sci.Hist.Bull. 15 (2), 231-234 (1976).
- Yunis, A. A., Arimura, G. K. Enzymes of glycogen metabolism in white blood cells. I. glycogen phosphorylase in normal and leukemic human leukocytes. Cancer, Res. 24, 489-492 (1964).
- Hagemans, M. L., et al. PAS-positive lymphocyte vacuoles can be used as diagnostic screening test for pompe disease. J. Inherit. Metab. Dis. 33 (2), 133-139 (2010).
- Totsuka, Y., et al. Physical performance and soleus muscle fiber composition in wild-derived and laboratory inbred mouse strains. 95 (2), 720-727 (2003).
- Murat, J. C., Serfaty, A. Simple enzymatic determination of polysaccharide (glycogen) content of animal tissues. Clin. Chem. 20 (12), 1576-1577 (1974).
- Arrizabalaga, O., Lacerda, H. M., Zubiaga, A. M., Zugaza, J. L. Rac1 protein regulates glycogen phosphorylase activation and controls interleukin (IL)-2-dependent T cell proliferation. J. Biol. Chem. 287 (15), 11878-11890 (2012).
- Pelletier, J., G, J., Mazure, N. M. Biochemical titration of glycogen in vitro. J.Vis.Exp. (81), (2013).
- Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D. Tagliabracci V.S. Glycogen and its metabolism: Some new developments and old themes. Biochem.J. 441 (3), 763-787 (2012).
- Salmoral, E. M., Tolmasky, D. S., Krisman, C. R. Evidence for the presence of glycogen in rat thymus. Cell Mol.Biol. 36 (2), 163-174 (1990).
- Darlington, P. J., et al. Diminished Th17 (not Th1) responses underlie multiple sclerosis disease abrogation after hematopoietic stem cell transplantation. Ann.Neurol. 73 (3), 341-354 (2013).
