요오드 산 쉬프 염색 말초 혈액 단핵 세포에서 글리코겐을 감지
Summary
Periodic acid Schiff staining is a technique that visualizes the polysaccharide content of tissues. This article demonstrates periodic acid Schiff staining protocol adapted for use on peripheral blood mononuclear cells purified from human venous blood. Such samples are enriched for lymphocytes and other white blood cells of the immune system.
Abstract
Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. Polysaccharides such as glycogen, glycoproteins, and glycolipids stain bright magenta making it easy to enumerate positive and negative cells within the tissue. In muscle cells PAS staining is used to determine the glycogen content in different types of muscle cells, while in blood cell samples PAS staining has been explored as a diagnostic tool for a variety of conditions. Blood contains a proportion of white blood cells that belong to the immune system. The notion that cells of the immune system possess glycogen and use it as an energy source has not been widely explored. Here, we describe an adapted version of the PAS staining protocol that can be applied on peripheral blood mononuclear immune cells from human venous blood. Small cells with PAS-positive granules and larger cells with diffuse PAS staining were observed. Treatment of samples with amylase abrogates these patterns confirming the specificity of the stain. An alternate technique based on enzymatic digestion confirmed the presence and amount of glycogen in the samples. This protocol is useful for hematologists or immunologists studying polysaccharide content in blood-derived lymphocytes.
Introduction
요오드 산 쉬프 (PAS) 염색 널리 근육 연구 및 진단에 사용되는 면역 조직 화학 기술이다. 또한, 혈액 샘플에 대한 진단 도구로서 이용된다. 기술은 무색 쉬프 시약함으로써 진한 색 마젠타 생성물을 생산하는 반응 생성 다당류 알데히드기 유닛 내에 샘플을 산화에 요오드 산 용액을 적용하여 작동한다. 이 절차의 단계는 그림 1에 나타내었다. 얼룩은 글리코겐, 당 단백질, 당지질, 점액, 또는 다당류 부분과 다른 분자를 포함하는 다당류 마젠타, 아무것도를 켭니다.
PAS 염색 종종 근육 섬유의 글리코겐 수준을 측정하기 위해 사용된다. 근육 조직 섹션은 단단히 슬라이드에 부착하고 여러 세척 및 염색 단계를 견딜로 기술에 이상적이다. 글리코겐은 높은 수요가 유형 II 근육 섬유, 빠른 트 위치에서 가장 존재최대 성능 1,2 글리코겐을 필요로하는 빠른 ATP 생산을위한. 글리코겐은 글리코겐 포스 포 릴라 제 효소의 작용을 통해 무료 포도당으로 분해 될 수있는 포도당의 분 지형 중합체이다. 휴식과 영양 자족의 시대에, 글리코겐, glycogenesis의 과정을 통해 보충하는 동안 영양 부족 또는 고 에너지 수요의 시대; 글리코겐은 글리코겐 분해에 의해 포도당으로 분해된다. 혈액 샘플에 이른 1950의 임상의 과학자들이 탐험으로 PAS 염색에서 각종 질병 3-7 글리코겐 함량을 분석합니다. 예를 들어, 폼 페병 질환-진실한 글리코겐 저장 질환 -에 백혈구 건강한 대조군 (8)로부터 크게 다르다 글리코겐 대량 축적된다.
이 비디오 문서에는 말초 혈 단핵 세포 (PBMC) 건강한 피험자에서의 정맥혈 샘플에 대한 사용 PAS 염색 적응 버전을 보여준다. PBMCS는 자연 살해 세포 및 단핵구와 같은 T 림프구와 B 림프구 가정뿐만 아니라 다른 면역 세포 림프구를 주로 함유한다. 제 정제 단계는 적혈구, 호중구 및 다른 과립구를 제거한다. 이 기술은 전체 혈액 도말하여 PAS에 비하여 양성 세포보다 강력한 열거 허용 림프구의 농축 비율에 데이터를 제공한다.
도 1 :. PBMC에 PAS 염색 단계 방법에 의해 단계 (A) 우선, PBMC 단리는 피콜 구배 통해 이루어진다는, 왼쪽 패널 원심 분리 전에 제제를 도시 오른쪽 패널은 원심 분리 후를 도시 PBMC를 포함하는 버피 코트 관의 중심에서 관찰된다. (B)가 격리 된 PBMC 포르말린 – 에탄올 고착성을 사용 솔루 슬라이드에 고정되고기. 슬라이드 부드럽게 세척 플라스틱 병에서 증류수로 세정한다. (C)는 슬라이드 글리코겐 용해 아밀라제 용액으로 채워진 100 ㎖ 비이커 반쯤에 배치된다. 슬라이드 부드럽게 세정한다. (D)는 슬라이드 당류의 산화가 일어나는 요오드 산 용액으로 처리한다. 슬라이드 부드럽게 씻어 준다; 이는 과량의과 요오드 산을 제거하고 산화 공정을 중지한다. (E)을 쉬프 시약이 슬라이드에 첨가 될 때, 산화 단계 동안 만들어 알데히드와 반응 할 것이다. 이 무색 시약은 깊은 붉은 마젠타 제품에서 발생합니다. 슬라이드는 부드럽게 초과 쉬프 시약을 제거하기 위해 세척한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 비디오 문서의 중요한 단계는 세포의 세척 및 아밀라아제 치료 중이었다. 슬라이드를 세척하는 동안, 키 단계는 플라스틱 짤 세척 병을 사용하고 물이 부드럽게 슬라이드에 샘플을 통해 실행시키는 및 샘플에 직접 목표로하지 않았다. 조금이라도 물을 직접 압력은 슬라이드를 나서야 세포를 일으킬 것입니다. 또 다른 중요한 단계는 ± 아밀라아제 조건에 대해 동일한 슬라이드를 사용하는 것?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by a grant from the NSERC Discovery program grant number RGPIN 418522-2013. We thank R. Kilgour for helpful discussions, and Katelin Gresty and Dr. A. Berghdal for providing the mouse muscle sections.
Materials
| Periodic Acid Shiff Kit | Sigma-Aldrich | 395B | Bring to room temperature prior to use. Materials in this kit are toxic and harmful. Use caution http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/395b?lang=en®ion=CA |
| α-Amylase from porcine pancreas | Sigma-Aldrich | A3176 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a3176?lang=en®ion=CA |
| Binocular Microscope | Carl Zeiss Microscopy | Axio Lab A0 | |
| Glycogen Assay Kit | Sigma-Aldrich | MAK016 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/mak016?lang=en®ion=CA |
| Ficoll-Paque PLUS | VWR, GE Healthcare | 17-1440-02 | Nonionic synthetic polymer of sucrose https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4779441 |
| Centrifuge | For PBMC isolation, swing buckets were used |
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