Одновременное количественное определение Т-клеточного рецептора иссечение Круги (TRECs) и K-Удаление рекомбинация Вырезание кругов (KRECs) по ПЦР в реальном времени
Summary
Here, we describe a method for simultaneous quantification of T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs). The TREC/KREC assay can be used as marker of thymic and bone marrow output.
Abstract
T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination process that creates T- and B-cell receptors. Because TRECs and KRECs are unable to replicate, they are diluted after each cell division, and therefore persist in the cell. Their quantity in peripheral blood can be considered as an estimation of thymic and bone marrow output. By combining well established and commonly used TREC assay with a modified version of KREC assay, we have developed a duplex quantitative real-time PCR that allows quantification of both newly-produced T and B lymphocytes in a single assay. The number of TRECs and KRECs are obtained using a standard curve prepared by serially diluting TREC and KREC signal joints cloned in a bacterial plasmid, together with a fragment of T-cell receptor alpha constant gene that serves as reference gene. Results are reported as number of TRECs and KRECs/106 cells or per ml of blood. The quantification of these DNA fragments have been proven useful for monitoring immune reconstitution following bone marrow transplantation in both children and adults, for improved characterization of immune deficiencies, or for better understanding of certain immunomodulating drug activity.
Introduction
Т-клеточный рецептор вырезания кругов (TRECs) и К-удаление рекомбинации вырезания кругов (KRECs) малы циклической ДНК-элементы, которые вырезают в количестве Т- и В-клеток, соответственно, в течение геномной ДНК процессе рекомбинации, что приводит к формирование высокой диверсификации репертуара Т- и В-клеточных рецепторов. Они не имеют функции, а потому, что они стабильны и не могут быть воспроизведены, они разбавляют после каждого деления клеток, таким образом, сохраняющиеся только в одной из двух дочерних клеток. Таким образом, их уровни в периферической крови можно предположить, в качестве оценки выхода тимуса и костного мозга.
В то время как анализ TREC был в значительной степени используются на протяжении последних 15 лет, чтобы оценить степень в тимусе, 1 анализ KREC, который был первоначально разработан для измерения пролиферации В-клеток и свой вклад в B-клеточного гомеостаза в норме и патологии, 2 был недавно предложена в качестве маркера костного мстрелка выход. 3,4 Здесь мы опишем метод было разработано для одновременного количественного обоих TRECs и KRECs. 4
С помощью этого комбинированного метода, изменчивость связана с количественной ДНК путем ПЦР в реальном времени устраняется за счет использования уникального стандартной кривой, полученной путем разбавления тройной вставки плазмиды, содержащей фрагменты TRECs, KRECs и Т-клеток постоянной рецептора альфа (TCRAC) Ген в соотношении 1: 1: 1. Это позволяет более точную оценку числа копий TREC и KREC. Более того, одновременное количественное определение двух целей в одной и той же реакции позволяет уменьшить затраты реагентов.
Предложил TREC / KREC анализ может быть полезен для определения степени Т- и В-клеток нео-производство у детей и взрослых с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID), 4 общий вариабельный иммунодефицит, 5 аутоиммунных заболеваний, 6-8 и ВИЧ-инфекции . 9 Кроме того, могут быть использованы дляследить за восстановления иммунитета после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, 10 ферменто, 11 и противовирусное 9 или иммуномодулирующие терапии. 6-8 Наконец, поскольку SCID пациентов отражаются с использованием TREC анализа, несмотря на базовых генетических дефектов, и агаммаглобулинемия пациенты могут быть идентифицированы с использованием Krec количественное , анализ TREC / KREC также может быть использован для обнаружения иммунодефициты у новорожденных программ скрининга. 12 В этом случае, тест должен быть выполнен на ДНК, выделенной из малых пятен крови смыл и сушат на фильтровальной бумаге, должна быть высокой чувствительностью и специфичностью для целевые заболевания, а также высокую воспроизводимость и экономически эффективным.
Введение KREC количественного в тесте должно улучшить выступления обследование новорожденных на иммунодефициты, которая обычно была выполнена в некоторых районах США (Висконсин, MA, CA), начиная с 2008 года, когда штат Висконсин стал первым Вве анализ TRECs в послеродовой программы скрининга. 13
Protocol
Representative Results
Discussion
TREC and KREC quantification can be considered a good estimate of recent thymic and bone marrow output provided that some caveats are taken into account. Even though an absolute quantification method employing standard curve requires more reagents and more space on the real-time PCR reaction plate, it ensures highly accurate quantitative results because unknown sample quantities are interpolated from standard curves built upon known amounts of starting material. Moreover this method is better fitted to detect low amount …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Histopaque-1077 | Sigma Aldrich SRL | 10771-500 ML | density gradient separation method |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit (250) | QIAGEN | 51106 | DNA extraction |
| Unmodified DNA Oligonucleotides HPSF 0.01 mmol | Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l | Resuspend the lyophilized product to 100 picmol/µl | |
| AmpliTaq DNA Polymerase: including 10x Buffer II and 25mM MgCl2 | Applied Biosystems/Life-Technologies | N8080156 | |
| GeneAmp dNTP Blend (100 mM) | Applied Biosystems/Life-Technologies | N8080261 | |
| TOPO TA Cloning Kit for Subcloning | Invitrogen/Life-Technologies | K4500-01 | |
| XL1-Blue Subcloning Grade Competent Cells | Stratagene | 200130 | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
| SpeI 500U | New England Biolabs | R0133S | |
| HindIII-HF 10,000 U | New England Biolabs | R3104S | |
| PureYield Plasmid Midiprep System | Promega | A2492 | |
| XhoI 5,000 U | New England Biolabs | R0146S | |
| TRIS Utrapure | Sigma Aldrich SRL | T1503 | |
| EDTA | Sigma Aldrich SRL | E5134 | |
| TE buffer (1 mM TRIS and 0.1 mM EDTA) | |||
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems/Life-Technologies | 4364338 | |
| Dual labeled probes HPLC 0.01 mmol | Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l | Resuspend the lyophilized product to 100 picmol/µl | |
| NanoDrop 2000c spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler | Applied Biosystems/Life-Technologies | 4359659 | |
| Fast 7500 Real-Time PCR system | Applied Biosystems/Life-Technologies | ||
| SDS Sequence Detection Software 1.4 | Applied Biosystems/Life-Technologies |
Referências
- Douek, D. C., et al. Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection. Nature. 396 (6712), 690-695 (1998).
- Zelm, M. C., Szczepanski, T., van der Burg, M., van Dongen, J. J. M. Replication history of B lymphocytes reveals homeostatic proliferation and extensive antigen-induced B cell expansion. J. Exp. Med. 204 (3), 645-655 (2007).
- Fronkova, E., et al. B-cell reconstitution after allogeneic SCT impairs minimal residual disease monitoring in children with ALL. Bone Marrow Transplant. 42 (3), 187-196 (2008).
- Sottini, A., et al. Simultaneous quantification of recent thymic T-cell and bone marrow B-cell emigrants in patients with primary immunodeficiency undergone to stem cell transplantation. Clin. Immunol. 136 (2), 217-227 (2010).
- Serana, F., et al. Thymic and bone marrow output in patients with common variable immunodeficiency. J. Clin. Immunol. 31 (4), 540-549 (2011).
- Zanotti, C., et al. Opposite effects of interferon-β on new B and T cell release from production sites in sclerosis. J. Neuroimmunol. 240-241, 147-150 (2011).
- Zanotti, C., et al. Peripheral accumulation of newly produced T and B lymphocytes in natalizumab-treated multiple sclerosis patients. Clin. Immunol. 145 (1), 19-26 (2012).
- Sottini, A., et al. Pre-existing T- and B-cell defects in one progressive multifocal leukoencephalopathy patient. PLoS One. 7, e34493 (2012).
- Quiros-Roldan, E., et al. Effects of combined antiretroviral therapy on B- and T-cell release from production sites in long-term treated HIV-1+ patients. J. Transl. Med. 10, 94 (2012).
- Mensen, A., et al. Utilization of TREC and KREC quantification for the monitoring of early T- and B-cell neogenesis in adult patients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. J. Transl. Med. 11, 188 (2013).
- Serana, F., et al. The different extent of B and T cell immune reconstitution after hematopoietic stem cell transplantation and enzyme replacement therapies in SCID patients with adenosine deaminase deficiency. J. Immunol. 185 (12), 7713-7722 (2010).
- Borte, S., et al. Neonatal screening for severe primary immunodeficiency diseases using high-throughput triplex real-time PCR. Blood. 119 (11), 2552-2555 (2012).
- Baker, M. W., et al. Implementing routine testing for severe combined immunodeficiency within Wisconsin’s newborn screening program. Public Health Rep. 125 (2), 88-95 (2010).
- Lorenzi, A. R., et al. Determination of thymic function directly from peripheral blood: a validated modification to an established method. J. Immunol. Meth. 339 (2), 185-194 (2008).
- De Boer, R. J., Perelson, A. S. Quantifying T lymphocyte turnover. J. Theor. Biol. 327, 45-87 (2013).
