Quantificazione simultanea di T-Cell Receptor Excision Circles (TREC) e Circles K-Eliminazione ricombinazione Excision (KRECs) per Real-time PCR
Summary
Here, we describe a method for simultaneous quantification of T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs). The TREC/KREC assay can be used as marker of thymic and bone marrow output.
Abstract
T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination process that creates T- and B-cell receptors. Because TRECs and KRECs are unable to replicate, they are diluted after each cell division, and therefore persist in the cell. Their quantity in peripheral blood can be considered as an estimation of thymic and bone marrow output. By combining well established and commonly used TREC assay with a modified version of KREC assay, we have developed a duplex quantitative real-time PCR that allows quantification of both newly-produced T and B lymphocytes in a single assay. The number of TRECs and KRECs are obtained using a standard curve prepared by serially diluting TREC and KREC signal joints cloned in a bacterial plasmid, together with a fragment of T-cell receptor alpha constant gene that serves as reference gene. Results are reported as number of TRECs and KRECs/106 cells or per ml of blood. The quantification of these DNA fragments have been proven useful for monitoring immune reconstitution following bone marrow transplantation in both children and adults, for improved characterization of immune deficiencies, or for better understanding of certain immunomodulating drug activity.
Introduction
Cerchi escissione recettore T-cellulare (TREC) e cerchi ricombinazione di escissione-K (eliminazione KRECs) sono piccoli elementi di DNA della circolare che vengono asportate in una proporzione di T e cellule B, rispettivamente, durante un processo di ricombinazione DNA genomico, portando alla formazione di un repertorio altamente diversificato di T e dei recettori delle cellule B. Essi non hanno alcuna funzione, ma perché sono stabili e non possono essere replicate, vengono diluiti dopo ogni divisione cellulare, persistendo quindi solo in una delle due cellule figlie. Pertanto, i livelli nel sangue periferico può essere assunta come una stima della produzione del midollo osseo e timo.
Mentre il test TREC è stato ampiamente utilizzato nel corso degli ultimi 15 anni per valutare l'entità della produzione del timo, 1 il test KREC, che è stato sviluppato inizialmente per misurare la proliferazione delle cellule B e il suo contributo alla omeostasi delle cellule B in salute e malattia, 2 è stato solo di recente proposto come marker di osso mfreccia in uscita. 3,4 Qui, descriviamo il metodo che abbiamo sviluppato per la quantificazione simultanea di entrambi TREC e KRECs. 4
Con questo metodo combinato, la variabilità associata quantificazione DNA da PCR in tempo reale è eliminata mediante l'uso di una curva standard unico ottenuta diluendo un plasmide triplo inserto contenente frammenti di TREC, KRECs e T-costante di cella recettore alfa (TCRAC) gene in un rapporto 1: 1: 1. Questo permette una valutazione più accurata del numero di copie TREC e KREC. Inoltre, la quantificazione simultanea dei due bersagli nella stessa reazione permette la riduzione dei costi dei reagenti.
La proposta di test TREC / KREC può essere utile per misurare il grado di T e cellule B neo-produzione in bambini o adulti con grave immunodeficienza combinata (SCID), 4 immunodeficienza variabile comune, 5 malattie autoimmuni, 6-8 e l'infezione da HIV . 9 Inoltre, può essere utilizzato permonitorare il recupero immunitario dopo il trapianto di cellule staminali emopoietiche, 10 enzimatica sostitutiva, 11 e antivirale 9 o immunomodulanti terapie. 6-8, infine, perché i pazienti SCID sono rilevati sulla base del test TREC nonostante i difetti genetici sottostanti, e agammaglobulinemia pazienti possono essere identificati usando KREC quantificazione , il dosaggio TREC / KREC può essere utilizzato anche per rilevare immunodeficienze in programmi di screening neonatale. 12 In questo caso, la prova deve essere eseguita su DNA estratto da piccole macchie di sangue cancellato ed essiccato su carta da filtro, deve essere altamente sensibile e specifico per le malattie in questione, così come altamente riproducibile e conveniente.
L'introduzione di KREC quantificazione nel test dovrebbe migliorare le prestazioni di screening neonatale per la immunodeficienze, che è stato regolarmente effettuato nel alcune parti degli Stati Uniti (WI, MA, CA) dal 2008, quando Wisconsin è diventato il primo e introduzionee l'analisi del TREC nel suo programma di screening postnatale. 13
Protocol
Representative Results
Discussion
TREC and KREC quantification can be considered a good estimate of recent thymic and bone marrow output provided that some caveats are taken into account. Even though an absolute quantification method employing standard curve requires more reagents and more space on the real-time PCR reaction plate, it ensures highly accurate quantitative results because unknown sample quantities are interpolated from standard curves built upon known amounts of starting material. Moreover this method is better fitted to detect low amount …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Histopaque-1077 | Sigma Aldrich SRL | 10771-500 ML | density gradient separation method |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit (250) | QIAGEN | 51106 | DNA extraction |
| Unmodified DNA Oligonucleotides HPSF 0.01 mmol | Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l | Resuspend the lyophilized product to 100 picmol/µl | |
| AmpliTaq DNA Polymerase: including 10x Buffer II and 25mM MgCl2 | Applied Biosystems/Life-Technologies | N8080156 | |
| GeneAmp dNTP Blend (100 mM) | Applied Biosystems/Life-Technologies | N8080261 | |
| TOPO TA Cloning Kit for Subcloning | Invitrogen/Life-Technologies | K4500-01 | |
| XL1-Blue Subcloning Grade Competent Cells | Stratagene | 200130 | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
| SpeI 500U | New England Biolabs | R0133S | |
| HindIII-HF 10,000 U | New England Biolabs | R3104S | |
| PureYield Plasmid Midiprep System | Promega | A2492 | |
| XhoI 5,000 U | New England Biolabs | R0146S | |
| TRIS Utrapure | Sigma Aldrich SRL | T1503 | |
| EDTA | Sigma Aldrich SRL | E5134 | |
| TE buffer (1 mM TRIS and 0.1 mM EDTA) | |||
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems/Life-Technologies | 4364338 | |
| Dual labeled probes HPLC 0.01 mmol | Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l | Resuspend the lyophilized product to 100 picmol/µl | |
| NanoDrop 2000c spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler | Applied Biosystems/Life-Technologies | 4359659 | |
| Fast 7500 Real-Time PCR system | Applied Biosystems/Life-Technologies | ||
| SDS Sequence Detection Software 1.4 | Applied Biosystems/Life-Technologies |
Referências
- Douek, D. C., et al. Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection. Nature. 396 (6712), 690-695 (1998).
- Zelm, M. C., Szczepanski, T., van der Burg, M., van Dongen, J. J. M. Replication history of B lymphocytes reveals homeostatic proliferation and extensive antigen-induced B cell expansion. J. Exp. Med. 204 (3), 645-655 (2007).
- Fronkova, E., et al. B-cell reconstitution after allogeneic SCT impairs minimal residual disease monitoring in children with ALL. Bone Marrow Transplant. 42 (3), 187-196 (2008).
- Sottini, A., et al. Simultaneous quantification of recent thymic T-cell and bone marrow B-cell emigrants in patients with primary immunodeficiency undergone to stem cell transplantation. Clin. Immunol. 136 (2), 217-227 (2010).
- Serana, F., et al. Thymic and bone marrow output in patients with common variable immunodeficiency. J. Clin. Immunol. 31 (4), 540-549 (2011).
- Zanotti, C., et al. Opposite effects of interferon-β on new B and T cell release from production sites in sclerosis. J. Neuroimmunol. 240-241, 147-150 (2011).
- Zanotti, C., et al. Peripheral accumulation of newly produced T and B lymphocytes in natalizumab-treated multiple sclerosis patients. Clin. Immunol. 145 (1), 19-26 (2012).
- Sottini, A., et al. Pre-existing T- and B-cell defects in one progressive multifocal leukoencephalopathy patient. PLoS One. 7, e34493 (2012).
- Quiros-Roldan, E., et al. Effects of combined antiretroviral therapy on B- and T-cell release from production sites in long-term treated HIV-1+ patients. J. Transl. Med. 10, 94 (2012).
- Mensen, A., et al. Utilization of TREC and KREC quantification for the monitoring of early T- and B-cell neogenesis in adult patients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. J. Transl. Med. 11, 188 (2013).
- Serana, F., et al. The different extent of B and T cell immune reconstitution after hematopoietic stem cell transplantation and enzyme replacement therapies in SCID patients with adenosine deaminase deficiency. J. Immunol. 185 (12), 7713-7722 (2010).
- Borte, S., et al. Neonatal screening for severe primary immunodeficiency diseases using high-throughput triplex real-time PCR. Blood. 119 (11), 2552-2555 (2012).
- Baker, M. W., et al. Implementing routine testing for severe combined immunodeficiency within Wisconsin’s newborn screening program. Public Health Rep. 125 (2), 88-95 (2010).
- Lorenzi, A. R., et al. Determination of thymic function directly from peripheral blood: a validated modification to an established method. J. Immunol. Meth. 339 (2), 185-194 (2008).
- De Boer, R. J., Perelson, A. S. Quantifying T lymphocyte turnover. J. Theor. Biol. 327, 45-87 (2013).
