Gelijktijdige Kwantificering van de T-cel receptor Excisie cirkels (TRECS) en K-verwijderen recombinatie Excisie cirkels (KRECs) van Real-time PCR
Summary
Here, we describe a method for simultaneous quantification of T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs). The TREC/KREC assay can be used as marker of thymic and bone marrow output.
Abstract
T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination process that creates T- and B-cell receptors. Because TRECs and KRECs are unable to replicate, they are diluted after each cell division, and therefore persist in the cell. Their quantity in peripheral blood can be considered as an estimation of thymic and bone marrow output. By combining well established and commonly used TREC assay with a modified version of KREC assay, we have developed a duplex quantitative real-time PCR that allows quantification of both newly-produced T and B lymphocytes in a single assay. The number of TRECs and KRECs are obtained using a standard curve prepared by serially diluting TREC and KREC signal joints cloned in a bacterial plasmid, together with a fragment of T-cell receptor alpha constant gene that serves as reference gene. Results are reported as number of TRECs and KRECs/106 cells or per ml of blood. The quantification of these DNA fragments have been proven useful for monitoring immune reconstitution following bone marrow transplantation in both children and adults, for improved characterization of immune deficiencies, or for better understanding of certain immunomodulating drug activity.
Introduction
T-cel receptor excisie cirkels (TRECS) en K verwijderen recombinatie excisie cirkels (KRECs) zijn kleine gecirculariseerde DNA-elementen die zijn uitgesneden in een verhouding van T- en B-cellen, respectievelijk, in een genomisch DNA recombinatie proces leidt tot de vorming van een zeer gediversifieerde repertoire van T- en B-celreceptoren. Zij hebben geen functie, maar omdat ze stabiel zijn en niet kunnen worden gerepliceerd, worden ze verdund na elke celdeling, waardoor aanhoudende slechts één van de twee dochtercellen. Daardoor kan het niveau in het perifere bloed worden aangenomen als een schatting van de thymus en beenmerg output.
Terwijl de TREC-test is grotendeels gebruikt in de afgelopen 15 jaar in de mate van thymus uitgang te evalueren, 1 de Krec assay, die aanvankelijk werd ontwikkeld om B-cel proliferatie en de bijdrage ervan aan de B-cel homeostase in gezondheid en ziekte, 2 meten is pas recent voorgesteld als een marker van bot marrow uitgang. 3,4 Hier beschrijven we de methode die we ontwikkeld voor de gelijktijdige kwantificering van zowel TRECS en KRECs. 4
Met deze gecombineerde methode wordt de variabiliteit geassocieerd DNA kwantificatie door real-time PCR geëlimineerd door het gebruik van een unieke standaardcurve verkregen door verdunning van een triple-insertie plasmide bevattende fragmenten van TRECS, KRECs en T-celreceptor alfa constante (TCRAC) gen in een 1: 1: 1 verhouding. Dit maakt een meer nauwkeurige evaluatie van de TREC en Krec copy number. Verder is de gelijktijdige kwantificering van de twee doelen in dezelfde reactie laat reagens kostenreductie.
De voorgestelde TREC / Krec test kan nuttig zijn om de omvang van T- en B-cellen neo-productie bij kinderen of volwassenen met ernstige gecombineerde immuundeficiëntie (SCID), 4 Hypogammaglobulinemie, 5 autoimmuunziekten, 6-8 en HIV-infectie meten Voorts. 9, kan het worden gebruikt ombewaken van het immuunsysteem herstel na hematopoietische stamceltransplantatie, 10 enzymvervanging, 11 en antivirale 9 of immunomodulerende therapieën. 6-8 slot omdat SCID patiënten worden opgenomen op basis van TREC test ondanks de onderliggende genetische defecten, en agammaglobulinemie patiënten kunnen worden geïdentificeerd met behulp van Krec kwantificering De TREC / Krec test kan ook worden gebruikt om immuundeficiënties detecteren bij pasgeboren screeningprogramma's. 12 In dit geval moet de test worden uitgevoerd op DNA geëxtraheerd uit kleine bloedvlekken geblot en gedroogd op filterpapier, moeten zeer gevoelig en specifiek zijn voor deze ziekten, evenals zeer reproduceerbare en kosteneffectief.
De invoering van Krec kwantificering in de test prestaties van pasgeboren screening voor immuundeficiënties die routinematig werd uitgevoerd in sommige delen van de Verenigde Staten (WI, MA, CA) sinds 2008 verbeteren wanneer Wisconsin werd eerste Inleidinge de analyse van TRECS in haar postnatale screening programma. 13
Protocol
Representative Results
Discussion
TREC and KREC quantification can be considered a good estimate of recent thymic and bone marrow output provided that some caveats are taken into account. Even though an absolute quantification method employing standard curve requires more reagents and more space on the real-time PCR reaction plate, it ensures highly accurate quantitative results because unknown sample quantities are interpolated from standard curves built upon known amounts of starting material. Moreover this method is better fitted to detect low amount …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Histopaque-1077 | Sigma Aldrich SRL | 10771-500 ML | density gradient separation method |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit (250) | QIAGEN | 51106 | DNA extraction |
| Unmodified DNA Oligonucleotides HPSF 0.01 mmol | Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l | Resuspend the lyophilized product to 100 picmol/µl | |
| AmpliTaq DNA Polymerase: including 10x Buffer II and 25mM MgCl2 | Applied Biosystems/Life-Technologies | N8080156 | |
| GeneAmp dNTP Blend (100 mM) | Applied Biosystems/Life-Technologies | N8080261 | |
| TOPO TA Cloning Kit for Subcloning | Invitrogen/Life-Technologies | K4500-01 | |
| XL1-Blue Subcloning Grade Competent Cells | Stratagene | 200130 | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
| SpeI 500U | New England Biolabs | R0133S | |
| HindIII-HF 10,000 U | New England Biolabs | R3104S | |
| PureYield Plasmid Midiprep System | Promega | A2492 | |
| XhoI 5,000 U | New England Biolabs | R0146S | |
| TRIS Utrapure | Sigma Aldrich SRL | T1503 | |
| EDTA | Sigma Aldrich SRL | E5134 | |
| TE buffer (1 mM TRIS and 0.1 mM EDTA) | |||
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems/Life-Technologies | 4364338 | |
| Dual labeled probes HPLC 0.01 mmol | Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l | Resuspend the lyophilized product to 100 picmol/µl | |
| NanoDrop 2000c spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler | Applied Biosystems/Life-Technologies | 4359659 | |
| Fast 7500 Real-Time PCR system | Applied Biosystems/Life-Technologies | ||
| SDS Sequence Detection Software 1.4 | Applied Biosystems/Life-Technologies |
Referências
- Douek, D. C., et al. Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection. Nature. 396 (6712), 690-695 (1998).
- Zelm, M. C., Szczepanski, T., van der Burg, M., van Dongen, J. J. M. Replication history of B lymphocytes reveals homeostatic proliferation and extensive antigen-induced B cell expansion. J. Exp. Med. 204 (3), 645-655 (2007).
- Fronkova, E., et al. B-cell reconstitution after allogeneic SCT impairs minimal residual disease monitoring in children with ALL. Bone Marrow Transplant. 42 (3), 187-196 (2008).
- Sottini, A., et al. Simultaneous quantification of recent thymic T-cell and bone marrow B-cell emigrants in patients with primary immunodeficiency undergone to stem cell transplantation. Clin. Immunol. 136 (2), 217-227 (2010).
- Serana, F., et al. Thymic and bone marrow output in patients with common variable immunodeficiency. J. Clin. Immunol. 31 (4), 540-549 (2011).
- Zanotti, C., et al. Opposite effects of interferon-β on new B and T cell release from production sites in sclerosis. J. Neuroimmunol. 240-241, 147-150 (2011).
- Zanotti, C., et al. Peripheral accumulation of newly produced T and B lymphocytes in natalizumab-treated multiple sclerosis patients. Clin. Immunol. 145 (1), 19-26 (2012).
- Sottini, A., et al. Pre-existing T- and B-cell defects in one progressive multifocal leukoencephalopathy patient. PLoS One. 7, e34493 (2012).
- Quiros-Roldan, E., et al. Effects of combined antiretroviral therapy on B- and T-cell release from production sites in long-term treated HIV-1+ patients. J. Transl. Med. 10, 94 (2012).
- Mensen, A., et al. Utilization of TREC and KREC quantification for the monitoring of early T- and B-cell neogenesis in adult patients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. J. Transl. Med. 11, 188 (2013).
- Serana, F., et al. The different extent of B and T cell immune reconstitution after hematopoietic stem cell transplantation and enzyme replacement therapies in SCID patients with adenosine deaminase deficiency. J. Immunol. 185 (12), 7713-7722 (2010).
- Borte, S., et al. Neonatal screening for severe primary immunodeficiency diseases using high-throughput triplex real-time PCR. Blood. 119 (11), 2552-2555 (2012).
- Baker, M. W., et al. Implementing routine testing for severe combined immunodeficiency within Wisconsin’s newborn screening program. Public Health Rep. 125 (2), 88-95 (2010).
- Lorenzi, A. R., et al. Determination of thymic function directly from peripheral blood: a validated modification to an established method. J. Immunol. Meth. 339 (2), 185-194 (2008).
- De Boer, R. J., Perelson, A. S. Quantifying T lymphocyte turnover. J. Theor. Biol. 327, 45-87 (2013).
