Batı Nil Virüsü Mutant Soy Enfeksiyon MyD88-aracılı Hücresel Bağışıklık Tepki Vitro Analizi
Summary
Two flow cytometry-based methods – an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.
Abstract
Farelerde, vahşi tip Batı Nil Virüsü daha yüksek doğal sitokin ve T hücresi tepkilerini bağlı bir zayıflatılmış Batı Nil virüsü (WNV), bir yapısal olmayan (NS) 4B-P38G mutantı. Son zamanlarda, miyeloid farklılaşma faktörü 88 (MyD88) sinyal Batı Nil Virüsü NS4B-P38G mutant enfeksiyon sırasında, ilk T hücresi uyarılması ve bellek T hücresi gelişimi için önemli olduğu gösterilmiştir. Bu çalışmada iki sitometri tabanlı yöntemler akış – Bir in vitro T hücre prime deneyi ve bir hücre içi sitokin boyama (ICS), – dendritik hücreler (DC) ve T hücre fonksiyonlarını değerlendirmek için kullanılmıştır. OTII transgenik farelerin, CD4 + T hücreleri etiketli – deneyi emişli T hücresi, hücre çoğalması karboksiflüoresein süksinimidil ester (CFSE) ile farelerin her iki grup DC'lerin ko-kültür, aşağıdaki akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. Önemli ölçüde gelenek daha genel duyarlılık geliştirilmiş olan bu yaklaşım, CD4 + T hücreleri çoğalan yüzdesi doğru belirlenmesi sağlanırark radyoaktif reaktifler ile deneyleri. Bir mikrosantrifüj tüpü sistemi ICS protokolünün iki hücre kültürü ve sitokin boyama prosedürleri kullanılmıştır. Geleneksel doku kültürü plaka tabanlı sisteme kıyasla, bu değiştirilmiş prosedür biyogüvenlik düzeyi (BL) 3 tesislerinde gerçekleştirmek için daha kolay oldu. Ayrıca, WNV- enfekte olmuş hücreler BL3 dışındaki daha sonraki analiz etkin analizlerde içinde paraformaldehit ile işleme tabi tutuldu. Genel olarak, bu in vitro bağışıklık tahlilleri, etkili bir Batı Nil Virüsü enfeksiyonu esnasında hücre-aracılı bağışıklık karşılıklarının değerlendirmek için de kullanılabilir.
Introduction
Batı Nil virüsü (BNV), bir nörotrop, artı-hissedilen flavivirüs, gelişmekte olan bir halk sağlığı tehdidi olduğunu. Şu anda, hiçbir aşı beşeri 1 için onaylanmıştır. Yapısal olmayan (NS) 4B protein bir P38G yer değişimine bir zayıflatılmış Batı Nil Virüsü soyu, vahşi tip Batı Nil Virüsü NY99 suşu 2'den farelerde hiçbir farelerde ölümcül bulunmuştur ancak daha yüksek doğal sitokin ve T hücresi tepkilerini teşvik ettiği bilinmektedir. NS4B-P38G mutant ile bağışıklık kazandırılmış fareler öldürücü doğal tipte Virüsü ile ikinci bir sorun korundu. Bu NS4B-P38G mutant ideal aşı adayı için uygun özelliklere sahip olduğunu göstermektedir. NS4B-P38G mutant yüksek koruyucu adaptif bağışıklığı hangi mekanizmalar henüz net olarak anlaşılamamıştır. Patojen ilişkili moleküler desenleri tanımaya Toll benzeri reseptörler (TLR), viral enfeksiyon karşı doğal bağışıklığın başlamasında önemli bir rol oynamaktadır. Çekirdek TLR sinyal yolu miyeloid farklılaşma birincil yanıt ge kullanırBirincil adaptörü 3,4 olarak ne 88 (MyD88). Yeni bir çalışmada, MyD88 sinyal farelerde 5 Batı Nil Virüsü NS4B- P38G mutant enfeksiyonu esnasında hücre aracılı bağışıklığın gelişiminde önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Dentritik hücreler (DC'ler), viral enfeksiyonun 6,7 sırasında birincil T hücresi tepkilerini başlatmak için benzersiz kapasitesini gösteren en önemli antijen sunan hücreler bulunmaktadır. CD4 + ve CD8 + T hücreleri, uzun süreli koruyucu bağışıklık katkı ve vahşi tip Batı Nil Virüsü enfeksiyonu 8,9 Aşağıdaki ana yaşaması için önemliyse her ikisi. İki immünolojik tahliller NS4B-P38G mutant amacıyla enfeksiyon bulaştırılan farelerde bu hücrelerin fonksiyonlarını belirlemek için bu çalışmada kullanılmıştır.
– / – Farelerde İlk olarak, in vitro T hücre prime deney Batı Nil Virüsü ile enfekte edilmiş yabani tip ve MyD88 arasında DC'lerin antijen sunan yeteneği karşılaştırmak için kullanılmıştır. Tahlil, naif CD4 <duyarlılığını artırmak içinCFSE (WNV enfekte edilmiş farelerin 339 DCler saflaştırıldı ve karboksiflüoresein süksinimidil paskalya birlikte kültürlenmiş – destek> + T hücreleri, 323 (OVA) peptidi tavuk ovalbümin için Vα2 / Vβ5 TCR ifade OTII transgenik farelerden izole edilmiştir OVA peptidi varlığında) -etiketli CD4 + T hücreleri. Ko-kültür içinde 5 gün sonra, hücreler hasat edilmiş ve paraformaldehit (PFA) ile tespit edilmiş ve akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. Çoğalma tahlilleri geleneksel bir 5-bromo-2'-deoksiüridin (BrdU) veya toz haline getirilmiş timin deoxyriboside (3 HTdr) 10 arasında dahil edilmesi yoluyla gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte, bu deneyler radyoaktif ve / veya BNV çalışmalarının yapıldığı biyogüvenlik düzeyi (BL) 3 tesislerde, özel ekipman ihtiyacı ya vardır. CFSE, daha yaygın hale imünolojik deneylerde kullandı vital boyanın flüoresan yoğunluğu seri yarılanmasına lenfosit çoğalmasının akış sitometrik analizi, boya daha stabil olduğu gibive eşit, hücrelere dahil flow sitometri ile kolayca tespit ve 11 radyoaktif olmayan bir. Tahlil, aynı zamanda, hücre bölünmesini belirlemek için yeteneği vardır. Batı Nil Virüsü çalışmalarda, bu tahlili kullanarak bir büyük avantajı,% 1-2 PFA ile enfekte olmuş hücrelerde tespiti, bir BL2 laboratuarda bir akış sitometresinde numune toplama sağlayacak WNV 12, etkisiz olmasıdır.
Daha sonra, bir tadil edilmiş hücre içi sitokin boyama (ICS) prosedürü MyD88 NS4B-P38G mutantı ile enfekte olmuş farelerde Batı Nil Virüsü spesifik T hücre karşılıklarının düzenlenmesinde sinyalleme rolünü incelemek için kullanılmıştır. Bu tahlilde, enfekte farelerinden yalıtılmış splenositlerin Batı Nil Virüsü spesifik peptidler ile in vitro muamele edildi. Brefeldin bir hücre içinde sitokin tutmak için ilave edildi. 5 saat inkübasyondan sonra, hücreler toplandı, yıkandı ve T hücre alt-gruplar için boyandı. Hücreler daha sonra, PFA sabit geçirgenleştirildi ve interferon (IFN) -γ boyanmış ve akış sitometrisi ile analiz edilmiştir.Hücreler tespit ve PFA içeren permeabilizasyon tampon maddesi ile muamele edilmiş bir kez başka akış sitometrisi bazlı bir deneyde olduğu gibi, enfekte örnekleri daha fazla işleme ve analizi için bir BL2 laboratuara aktarılır. Birkaç yayınlanan çalışmalarda, biz WNV-enfekte farelerde 13,14 T hücresi efektör fonksiyonları ölçmek için ICS kullandık. Iyi kurulmuş oluyor rağmen, bu testin bir büyük dezavantajı prosedürü çok uzun ve BL3 tesisleri içinde yapıldığında alıcı daha fazla zaman olabilir olduğunu. Burada, mikro-santrifüj tüpü tabanlı ICS yöntem daha uygun, daha kolay devam etmek ve daha az zaman BL3 laboratuar içinde gerçekleştirilen zaman alıcı olduğu gösterilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
BNV bir BL3 patojendir. Nedeniyle güvenlik yönetmeliklerine, WNV-enfekte örnekleri ile immünolojik testler genellikle BL3 tesisleri veya gerçekleştirmek için daha uzun ve sıkıcı bir ekipman durumu ile sınırlıdır. Yeni bir çalışmada, biz Batı Nil Virüsü enfeksiyonu 5. sırasında hücre aracılı bağışıklık yanıtlarını incelemek için iki akış sitometri tabanlı yöntemler kullanılır. Analizlerde, Batı Nil Virüsü ile enfekte edilmiş hücreler,% 1-2 PFA doğrudan ya da% 4 PFA…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grants to T.W. (R01AI072060 and R01AI099123). G. Xie was supported by a Sealy Center for Vaccine Development Predoctoral Fellowship. We thank Dr. Richard Flavell (Howard Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine, New Haven) and Dr. Shizuo Akira (Osaka University, Japan) for providing the MyD88–/– mice and Dr. Y Cong (UTMB, Galveston) for providing OTII transgenic mice.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | warm up at 37C |
| anti-CD11c magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | follow the manufacturer’s instructions |
| anti-CD4 magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-095-248 | follow the manufacturer’s instructions |
| CFSE | Invitrogen | C34554 | |
| OVA residue 323-339 | Genscript Corporation | RP10610 | |
| Peptides | Proimmune | PC0AD-D | |
| Brefeldin A solution | BD Bioscience | 555029 | |
| Mouse Fc Blocker | e-Bioscience | 14-0161-85 | |
| APC-conjugated CD4 | e-Bioscience | 17-0041-81 | |
| FITC-conjugated CD8 | e- bioscience | 11-0081-82 | |
| Fixation/Permeabilization Solution | BD- Bioscience | 554722 | |
| Permeabilization/wash buffer | BD- Bioscience | 554723 | |
| anti-IFNg-PE | e-Bioscience | 12-7311-82 | |
| Accuri flow cytometer | BD Bioscience |
Referências
- Campbell, G. L., Marfin, A. A., Lanciotti, R. S., Gubler, D. J. West Nile virus. Lancet Infect. Dis. 2, 519-529 (2002).
- Welte, T., et al. Immune responses to an attenuated West Nile virus NS4B-P38G mutant strain. Vaccine. 29, 4853-4861 (2011).
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Toll-like receptor control of the adaptive immune responses. Nat. Immunol. 5, 987-995 (2004).
- Akira, S., Hemmi, H. Recognition of pathogen-associated molecular patterns by TLR family. Immunol. Lett. 85, 85-95 (2003).
- Xie, G., et al. A West Nile virus NS4B-P38G mutant strain induces adaptive immunity via TLR7-MyD88-dependent and independent signaling pathways. Vaccine. 31 (38), 4143-4151 (2013).
- Fang, H., et al. gammadelta T cells promote the maturation of dendritic cells during West Nile virus infection. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 59, 71-80 (2010).
- Silva, M. C., Guerrero-Plata, A., Gilfoy, F. D., Garofalo, R. P., Mason, P. W. Differential activation of human monocyte-derived and plasmacytoid dendritic cells by West Nile virus generated in different host cells. J. Virol. 81, 13640-13648 (2007).
- Shrestha, B., Samuel, M. A., Diamond, M. S. CD8+ T Cells Require Perforin To Clear West Nile Virus from Infected Neurons. J. Virol. 80, 119-129 (2006).
- Wang, Y., Lobigs, M., Lee, E., Mullbacher, A. CD8+ T cells mediate recovery and immunopathology in West Nile virus encephalitis. J. Virol. 77, 13323-13334 (2003).
- Plebanski, M., Katsara, M., Sheng, K. C., Xiang, S. D., Apostolopoulos, V. Methods to measure T-cell responses. Expert Rev. Vaccines. 9, 595-600 (2010).
- Lyons, A. B. Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution. J. Immunol. Methods. 243, 147-154 (2000).
- Kraus, A. A., Priemer, C., Heider, H., Kruger, D. H., Ulrich, R. Inactivation of Hantaan virus-containing samples for subsequent investigations outside biosafety level 3 facilities. Intervirology. 48, 255-261 (2005).
- Saxena, V., et al. A hamster-derived west nile virus isolate induces persistent renal infection in mice. PLoS Negl. Trop. Dis. 7, 2275 (2013).
- Welte, T., et al. Vgamma4+ T cells regulate host immune response to West Nile virus infection. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 63, 183-192 (2011).
