In-vitro-Analyse Myd88-vermittelte zelluläre Immunantwort gegen das West-Nil-Virus-Infektion Mutantenstamm
Summary
Two flow cytometry-based methods – an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.
Abstract
Attenuiertes West Nile-Virus (WNV), eine nicht-strukturellen (NS) 4B-P38G Mutante induziert höhere angeborenen Cytokin und T-Zell-Antworten als die Wildtyp-WNV in Mäusen. Vor kurzem myeloischer Differenzierungsfaktor 88 (MyD88) Signalisierung wurde gezeigt, während WNV NS4B-P38G mutierte Infektion wichtig für erste T-Zell-Priming und Gedächtnis-T-Zell-Entwicklung zu sein. In dieser Studie wurden zwei Durchflusszytometrie basierenden Verfahren – eine in vitro T-Zell-Priming-Assay und eine intrazelluläre Zytokinfärbung (ICS) – wurden verwendet, um dendritische Zellen (DCs) und T-Zell-Funktion zu bewerten. Markierten CD4 + T-Zellen von OTII transgenen Mäusen – im T-Zell-Priming-Assay wurde die Zellproliferation durch Durchflusszytometrie folgenden Co-Kultur von DCs, die aus den beiden Gruppen von Mäusen mit Carboxyfluoresceinsuccinimidylester (CFSE) analysiert. Dieser Ansatz vorgesehen eine genaue Bestimmung des Prozentsatzes von proliferierenden CD4 + T-Zellen mit deutlich verbesserten Gesamtempfindlichkeit als der Traditional-Assays mit radioaktiven Reagenzien. Ein Reaktionsgefäß-System wurde in beiden Zellkultur und Zytokin Färbeverfahren des ICS-Protokoll verwendet. Im Vergleich zum herkömmlichen Gewebekulturplatte-basierte System, das war modifiziertes Verfahren einfacher, der Sicherheitsstufe (BL) 3 Einrichtungen durchzuführen. Außerdem wurden WNV- infizierten Zellen mit Paraformaldehyd in beiden Assays, die die weitere Analyse außerhalb BL3 Einrichtungen aktiviert behandelt. Insgesamt können diese in vitro immunologischen Assays verwendet werden, um zellvermittelte Immunreaktionen beim WNV-Infektion wirksam zu beurteilen.
Introduction
West-Nil-Virus (WNV), einem neurotropen plus-spürte Flavivirus, ist eine neue Bedrohung der öffentlichen Gesundheit. Derzeit sind keine Impfstoffe für den menschlichen Gebrauch 1 zugelassen. Attenuiertes WNV-Stamm, der eine P38G Substitution in der nicht-strukturellen (NS) 4B Protein, ist dafür bekannt, keine Letalität in Mäusen, aber höher angeborenen Zytokine und T-Zell-Antworten in Mäusen als Wildtyp WNV NY99-Stamm 2 induzieren. Mäuse, die mit der NS4B-P38G Mutante immunisiert wurden alle von einem sekundären Herausforderung mit tödlichen Wildtyp WNV geschützt. Dies deutet darauf hin, dass der NS4B-P38G Mutante geeigneten Eigenschaften für einen optimalen Impfstoffkandidaten. Die Mechanismen, mit denen die NS4B-P38G Mutante induziert hohe Schutz adaptiven Immunität noch nicht genau geklärt. Toll-like Rezeptoren (TLR), die pathogen-associated molecular patterns erkennen, spielen eine wesentliche Rolle bei der Initiierung der angeborenen Immunität zu Virusinfektion. Der Kern TLR-Signalweges nutzt myeloische Differenzierung primäre Antwort gene 88 (MyD88) als primärer Adapter 3,4. In einer neueren Studie wurde MyD88 Signalisierungs gezeigt, eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von zellvermittelter Immunität während WNV NS4B- P38G Mutante Infektion bei Mäusen 5 zu spielen. Dendritische Zellen (DCs) sind eines der wichtigsten Antigen-präsentierenden Zellen die einzigartige Fähigkeit, primären T-Zell-Reaktionen während der viralen Infektion zu initiieren 6,7 aufweist. CD4 + und CD8 + T-Zellen sowohl für langanhaltende schützende Immunität bei und sind wichtig für die Host-Überlebensrate nach Wildtyp WNV Infektion 8,9. Zwei immunologischen Assays wurden in dieser Studie verwendet, um die Funktionen dieser Zellen in der NS4B-P38G Mutante infizierten Mäusen zu beurteilen.
Zunächst wurde ein in vitro-T-Zell-Priming-Assay verwendet, um die Antigen-präsentierende Fähigkeit der DCs von WNV-infizierten Wildtyp-MyD88 und Vergleichen – / – Mäusen. Um die Empfindlichkeit des Assays, naive CD4 <erhöhensup> + T-Zellen wurden aus OTII transgenen Mäusen, die eine Vα2 / Vβ5 TCR spezifisch für das Hühner-Ovalbumin (OVA) Peptid exprimieren 323 isoliert – 339. DCs von WNV infizierten Mäusen wurden aufgereinigt und co-kultiviert mit Carboxyfluorescein Succinimidyl Ostern (CFSE ) -markierten CD4 + T-Zellen in Gegenwart von OVA-Peptid. Nach 5 Tagen gemeinsamer Kultur wurden die Zellen geerntet und mit Paraformaldehyd (PFA) fixiert und durch Durchflusszytometrie analysiert. Proliferationsassays wurden traditionell durch Einbau von 5-Brom-2'-desoxyuridin (BrdU) oder tritiiertem Thymin desoxyribosid (3 HTdR) 10 durchgeführt. Dennoch sind diese Assays entweder radioaktive und / oder benötigen spezielle Ausrüstungen der Sicherheitsstufe (BL) 3 Anlagen, wo WNV Studien durchgeführt werden. Die durchflusszytometrische Analyse von Lymphozyten-Proliferation durch serielle Halbierung der Fluoreszenzintensität des Vitalfarbstoffs CFSE geworden üblicherweise in immunologischen Assays verwendet werden, wie der Farbstoff stabilerund gleichmäßig in Zellen eingebaut, leicht durch Flusszytometrie nachgewiesen und ist nicht-radioaktiven 11. Der Test hat auch die Fähigkeit, die Anzahl der Zellteilungen zu beurteilen. Ein wesentlicher Vorteil der Verwendung dieser Assays in WNV Studien ist, dass die Fixierung der infizierten Zellen mit 1-2% PFA könnte WNV 12, die Probennahme mit einem Durchflußzytometer in einen BL2 Labor ermöglichen inaktivieren.
Als nächstes wurde ein modifiziertes intrazellulärem Zytokinfärbung (ICS) Verfahren verwendet, um die Rolle von MyD88 Signalisierung in der Regulation der WNV spezifische T-Zellantworten in NS4B-P38G Mutante infizierten Mäusen untersucht. In diesem Test wurden Splenozyten aus infizierten Mäusen isoliert in vitro mit WNV spezifischen Peptiden behandelt. Brefeldin A wurde zugegeben, um die Cytokine in der Zelle zurückzuhalten. Nach 5 h Inkubation wurden die Zellen geerntet, gewaschen und für die T-Zell-Subpopulationen gefärbt. Die Zellen wurden dann in PFA fixiert, permeabilisiert und für Interferon (IFN) -γ gefärbt und mittels Durchflusszytometrie analysiert.Wie bei anderen auf Basis der Durchflusszytometrie-Assay, nachdem die Zellen mit Fixierung und Permeabilisierung Puffer mit PFA behandelten, infizierten Proben können auf eine BL2 Labor zur weiteren Verarbeitung und Analyse übertragen. In mehreren veröffentlichten Studien haben wir ICS verwendet, um T-Zell-Effektorfunktionen in WNV-infizierten Mäusen 13,14 messen. Obwohl es gut etabliert ist, ist einen großen Nachteil dieses Tests, dass das Verfahren ist sehr langwierig und könnte mehr Zeit in Anspruch, wenn sie innerhalb BL3 Einrichtungen durchgeführt werden. Hier wurde ein Mikrozentrifugenröhrchen Basis ICS Verfahren gezeigt, dass mehr möglich ist, leichter zu gehen und weniger zeitaufwendig, wenn sie innerhalb einer BL3 Labor.
Protocol
Representative Results
Discussion
WNV ist ein BL3 Erregers. Aufgrund von Sicherheitsbestimmungen oder immunologische Assays mit WNV-infizierten Proben werden oft durch die Verfügbarkeit von Ausrüstung an BL3 Einrichtungen oder mehr langwierig und mühsam auszuführen beschränkt. In einer aktuellen Studie verwendeten wir zwei Durchflusszytometrie basierenden Verfahren zur zellvermittelten Immunreaktionen beim WNV-Infektion 5 untersuchen. In beiden Tests wurden WNV-infizierten Zellen, die mit 1-2% PFA direkt oder mit Fixierung / Permeabilisi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grants to T.W. (R01AI072060 and R01AI099123). G. Xie was supported by a Sealy Center for Vaccine Development Predoctoral Fellowship. We thank Dr. Richard Flavell (Howard Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine, New Haven) and Dr. Shizuo Akira (Osaka University, Japan) for providing the MyD88–/– mice and Dr. Y Cong (UTMB, Galveston) for providing OTII transgenic mice.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | warm up at 37C |
| anti-CD11c magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | follow the manufacturer’s instructions |
| anti-CD4 magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-095-248 | follow the manufacturer’s instructions |
| CFSE | Invitrogen | C34554 | |
| OVA residue 323-339 | Genscript Corporation | RP10610 | |
| Peptides | Proimmune | PC0AD-D | |
| Brefeldin A solution | BD Bioscience | 555029 | |
| Mouse Fc Blocker | e-Bioscience | 14-0161-85 | |
| APC-conjugated CD4 | e-Bioscience | 17-0041-81 | |
| FITC-conjugated CD8 | e- bioscience | 11-0081-82 | |
| Fixation/Permeabilization Solution | BD- Bioscience | 554722 | |
| Permeabilization/wash buffer | BD- Bioscience | 554723 | |
| anti-IFNg-PE | e-Bioscience | 12-7311-82 | |
| Accuri flow cytometer | BD Bioscience |
Referências
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