공동 문화 모델, 설립 GABA 성 중간 가시 신경 세포 및 HEK293 세포에서 억제 시냅스 형성 안정적으로 GABA를 표현 수용체

스프 라그 – 돌리 쥐 또는 BAB / C 근친 마우스, 영국 홈 오피스 [와 1986년 11월 24일의 유럽 공동체위원회 지침에 따라 보관 및 희생 (할란, 영국 사용 임신 한 여성의 수는 30이었다) (609분의 86 / EEC) ] 가이드 라인. 이 프로젝트는 공식적으로 약국 윤리위원회의 UCL 대학에 의해 승인되었습니다. 악기, 문화 매체, 그리고 요리 1. 준비 켜고 항상 무균 조건에서 작동하기 위해 70 % 에탄올과 층류 후드 청소. (L 글루타민 (2 mM)을, 페니실린 (50 유닛 / ㎖), 스트렙토 마이신 (50 ㎍ / ㎖), 및 소 태아 혈청 둘 베코 변형 이글 중간 산도 7.4 (DMEM, 500 ml)에 함유 10 HEK293 세포 배양 배지를 준비 %). 참고 : 페니실린과 스트렙토 마이신은 자극이다. 로 Neurobasal 배지의 pH가 7.4 (500 ㎖), B27 보충제 (25 ㎖), L – 글루타민 (2 mM)을 페니실린을 함유하는 무 혈청 신경 세포 배양 배지를 준비(50 단위 / ㎖), 스트렙토 마이신 (50 ㎍ / ㎖), 및 글루코스 (6 ㎜). HBSS 10 배 스톡 (50 ㎖), HEPES (1 M) (5 ml) 및 물 (445 ㎖), pH 7.4의 함유 HEPES 완충 식염수 용액 (HBSS) 500 ㎖에, 준비한다. 멸균 인산 완충 식염수 (PBS, pH 7.4의 1 L), 물 (1 L), 커버 글라스 (직경 13mm)를 찾아 살균 유리 파스퇴르 피펫. HEK293 안정적인 세포주 2. 준비 α1 / β3 / γ2-GABA의 R을 표현 10cm 멸균 조직 배양 플레이트에 플레이트 2 × 6 HEK293 세포는 하룻밤 70-90%의 포화 상태에 도달하기 위해 가습 5 % 이산화탄소 (CO 2) 분위기 (CO 2 인큐베이터)에서 37 ° С에서 배양한다. 다음날, G418의 설페이트 (표 1) 저항성 유전자를 통합 pcDN 3.1 (+) 발현 벡터 GABA R α1 서브 유니트 cDNA로 HEK293 세포를 형질및 phleomycin D1 통합 발현 벡터에서 GABA R β3 소단위의 cDNA (표 1) 내성 유전자 (모두 인간 사이토 메갈로 바이러스의 즉시 초기 (CMV) 프로모터의 조절 하) 음으로 복합체 양이온 성 리포좀 제제를 사용하여, 제조사의 프로토콜에 따라 충전 된 핵산 분자 (표 1). (pH 7.4의, 표 1) 간략하게, 감소 된 혈청 배지 500 ㎕를 추가하고 7.5 μg의를 cDNA를 리포좀 형질 버퍼링 시약 15 ㎕를 다음 멸균 15 ml의 원심 분리 관으로 구성하고, 부드럽게 실온에서 떠나기 전에 혼합 각 5 분. 이 혼합물에, 리포좀 형질 감염 시약 8.75 μl를 추가하고 부드럽게 30 분 동안 실온에서 떠나기 전에 혼합한다. 이 후, (항생제없이) HEK293 세포 배양 배지 3 ㎖을 추가 회 상하 transfe를 원심 관의 내용을 피펫R은 드롭 현명한 10cm 조직 배양 접시에서 성장하는 세포 상 및 가습 5 % CO 2 분위기 (CO 2 배양기)에서 37 ° С에서 48 시간 동안 배양한다. 다음과 같은 비율로, 멸균 PBS, pH를 7.4으로 가볍게 HEK293 세포를 씻으십시오, 새로운 10cm 조직 배양 접시에 형질 전환 된 HEK293 세포를 희석 : 1 : 3, 1 : 5, 1 : 7, 1:10 1:15 1:20. 이것은 세포가 지나치게 융합 될 수없는 것을 보장한다. 배양 배지에, 각각의 항생제 선별 마커, G418 및 Phleomycin D1 800 ㎍ / ml에 첨가하여 GABA R 서브 유닛 모두를 발현하는 HEK293 세포의 선택을 시작한다. 가습 된 5 % CO 2 분위기 (CO 2 배양기)에서 37 ° С에서 세포를 품어 항생제 함유 배지 (10 ml)을 2 일마다 교체합니다. 작은 흰색 식민지 (일반적으로 약 7 일 후)를 형성하기 시작하면, 조심스럽게 요리의 각각에서 하나의 식민지를 선택하고 멸균 P1000을 사용하여 수집피펫 팁. 상하 매체 피펫 팅하여 재현 탁 신중 500 ㎕의 배지를 함유하고, 24 웰 조직 배양 플레이트의 한 웰에 전송. 정확히 하나의 식민지 (5-20 식민지의 총이 좋습니다) 잘 각각에 전송되어 있는지 확인합니다. 가습 된 5 % CO 2 분위기 (CO 2 배양기)에서 37 ° С에서 세포를 품어 항생제 함유 배지를 2 일마다 교체합니다. 콜로니 70-80 %의 컨 플루 언트하게되면 부드럽게 24- 웰 조직 배양 플레이트의 바닥으로부터 세포를 이동시키다 상하 매체 피펫. 옮기고 6- 웰 조직 배양 플레이트에서 2 웰 사이의 세포 현탁액을 나눈다. 가습 된 5 % CO 2 분위기 (CO 2 배양기)에서 37 ° С에서 세포를 품어 항생제 함유 배지를 2 일마다 교체합니다. 일단 70 – 80 % 합류, 동일한 단일 결장 유래 세포를 함유하는 웰 (2) (1)로부터의 세포를 수집y를 준비 단백질 용 해물. 간략하게, 세포를 PBS, pH 7.4의 2 배속으로 세척하고, PBS, pH 7.4의 2 % 소듐 도데 실 설페이트 (SDS) 200 μl를 추가한다. 해물을 수집하고 microcentrifuge 관에 전송합니다. BCA 단백질 시약을 사용하여 단백질 농도를 측정 제조사의 프로토콜에 따라 (표 1 참조). 이들에 대한 정보는 표 1을 참조 SDS / PAGE에 의해 GABA 수용체의 α1 및 β3 서브 유닛의 발현을 분석하고 (토끼 반 α1 별과 토끼 반 β3 별 GABA R 항체 서브 유닛 특정 항체를 사용하여 면역 항체). 이동시키다 큰 6cm 조직 배양 접시에 남아있는 우물에서 유일한 긍정적 인 클론을 전송합니다. 가습 된 5 % CO 2 분위기 (CO 2 배양기)에서 37 ° С에서 세포를 품어 항생제 함유 배지를 2 일마다 교체합니다. 점차적으로 세포 U의 식민지를 확장10cm 조직 배양 접시에 마지막으로 조직 배양 플라스크 (T-75 플라스크)로 전송하여 항생제 선택 파인더. 가습 된 5 % CO 2 분위기 (CO 2 배양기)에서 37 ° С에서 세포를 품어 항생제 함유 배지를 2 일마다 교체합니다. 커버 글라스에 각 식민지에서 70,000 세포 (직경 13 mm)를 판과 면역에 의해 GABA R 서브 유닛의 세포 표면 발현과 공동 현지화를 분석하기 위해 세포를 고정합니다. (10cm 무균 조직 배양 접시에 GABA 수용체, 판 2 × 10 6 세포의 두 α1 및 β3 서브 유닛의 높은 수준을 발현하는 HEK293 세포의 긍정적 인 클론을 선택하고 가습 된 5 % CO 2 분위기에서 37 ° С 부화 CO 2 배양기) 하룻밤. 세포가 항상 항생제 함유 (G418 및 Phleomycin D1) 배지에서 배양되어 있는지 확인합니다. 다음 날, HEK를 형질GABA R 293 세포 pcDNA 벡터 ™ 3.1 (+) 비 리포솜 지질 형질 감염 시약 (표 1)를 사용하여 하이 그로 마이신 B 내성 유전자를 통합 발현 벡터 소단위의 cDNA를 γ2s. 참고 :이 형질 전환 방법은 더 나은 생존과 항생제 지속적인 선택을 받고있다 느린 성장 안정적인 세포주 외국 단백질의 높은 발현 효율을 할 수 있습니다. 멸균 15 ml의 원심 분리 튜브에 250 ㎕의 향상제 및 DNA 축합 완충액 (표 1)과 γ2s의 GABA 1.4 μg의 수용체 소단위의 cDNA를 추가한다. 5 분 동안 실온에서 떠나기 전에 1 초 동안 11.2 증강의 μL와 소용돌이를 추가합니다. 10 분 동안 실온에서 떠나기 전에 10 초 동안 비 리포좀 지질 형질 전환 시약와 소용돌이의 35 μl를 추가합니다. G418 / Phleomycin D1 함유 배지 3 ㎖을 첨가하고, 회 BEF 상하 원심 분리 튜브의 함유량을 피펫광석은 10cm 조직 배양 플레이트에서 성장하는 세포에 드롭 현명한 전송. 가습 된 5 % CO 2 분위기 (CO 2 배양기)에서 37 ° С에서 48 시간 동안 세포를 품어. 다음과 같은 비율로, 멸균 PBS로 부드럽게 세포를 씻고 새로운 10cm 조직 배양 접시로 희석 : 3, 1 : 1 ~ 5, 1 : 7, 1:10 1:15 1:20. γ2s 서브 유닛을 표현 / β3-HEK293 세포 / Phleomycin 매체 D1이 함유 G418에 항생제 선택 마커 하이 그로 마이신 B의 800 ㎍ / ㎖를 추가하여 α1의 선택을 시작합니다. 신선한 G418 / Phleomycin D1 / 하이 그로 마이신 B 함유 배지 (10 ml)을 2 일 간격으로 기존 매체를 교체합니다. 반복 G418 연속 선택에 따라, 2.7-2.12 단계 / Phleomycin D1 / 하이 그로 마이신 세포 배양 배지를 B 함유. 항생제가없는 세포 배양 배지 및 나중에 사용하기 위해 10 %의 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 -140 ° C에서 양성 클론을 보관. 레벨 테스트표현 때문에 항생제 선택에 따라 세포의 감소 생존 변경할 수 있기 때문에 α1, β3의 발현, 해동 다음 각 클론의 면역과 면역에 의해 GABA R 서브 유닛을 γ2s. HEK293 세포주 3. 유지 보수 15 ml의 멸균에 세포 배양 배지 10 ㎖로 (전술) 제어 HEK293 세포의 유리 병 또는 그 표현 α1 중 / β2 / γ2-GABA의 루피 (표 1) 또는 α1 / β3 / γ2-GABA의 R을 해동 원심 분리기 튜브. 5 분 440 XG에 원심 분리기를 초과 DMSO를 제거합니다. 신선한 세포 배양 배지 1 ml의 상등액과 세포를 분리에 resuspend. 우선 폴리 D 리신 (0.1 ㎎ / ㎖)에 재현 탁하고 세포를 다음 1 ㎖의 코팅 10cm 조직 배양 접시에 신선한 세포 배양 배지 9를 가하여. , 옆으로, 부드럽게 선동 세포를 분산하고 가습에 37 ° С 부화5 % CO 2 분위기 (CO 2 인큐베이터). 다음날, 어떤 세포 파편을 제거하고 신선한 HEK293 세포 배양 배지 10 ㎖로 교체 매체 대기음. GABA R 서브 유닛을 표현하기 때문에 또한 항생제 내성 마커의 발현이 부족하지 않는 세포를 제거하는 항생제 안정적인 세포주를 선택합니다. α1 / β2 / γ2 안정적인 세포주를 들어, G418 (800 ㎍ / ㎖)에 포함 된 신선한 세포 배양 매체와 일반 매체를 교체하십시오. α1 / β3 / γ2 세포주의 경우, 신선한 세포 배양 배지는 G418 께 (800 ㎍ / ㎖) 함유 교체 Phleomycin D1 (800 ㎍ / ㎖), 하이 그로 마이신 B (800 ㎍ / ㎖).주의! G418은 자극성이고 하이 그로 마이신 B는, 부식성 독성 및 자극이다. 통로 낮은 밀도로 파종하여 새로운 조직 배양 접시에 세포들은> 70 %의 컨 플루 언시를 달성되면. 기음 10 세포 배양 배지 ㎖의 짧게 두번 세척한다PBS, pH가 7.4. 1 트립신 EDTA 솔루션, 단백질 분해 효소 트립신 용액 (0.05 % 트립신)와 PBS에서 칼슘 킬레이트 EDTA (0.02 %), pH가 7.4, 접시에서 세포를 분리 할 수 ml의.주의! 트립신 – EDTA 추가 솔루션은 자극이다. 접시, 올바른 항생제를 함유하는 세포 배양 배지 10 ㎖를 첨가하고, 세포를 흡인. 5 분 440 XG에 세포를 원심 분리 세포 배양 배지 5ml에이를 재현 탁. 통로 신선한 세포 배양 배지 및 올바른 항생제를 함유하는 새로운 조직 배양 플라스크 (T-75 플라스크)로 1:10 희석하여 세포. 가습 된 5 % CO 2 분위기 (CO 2 배양기)에서 37 ° С에서 세포를 품어 매체마다 이일을 교체합니다. 통로 셀 때> 70 % 합류 (단계 2.8 참조). GABA 성 중간 가시 뉴런 문화 4. 준비 무균 조건 하에서 24 우리를 준비폴리 L 리신 (0.1 ㎎ / ㎖)와 LL 플레이트 커버 슬립을 코팅 처리 (직경 13mm) 및 가습 된 5 % CO 2 분위기 (CO 2 인큐베이터)에서 37 ° С에서 배양한다. 다음 날, 기음 피펫 초과 폴리 -L- 라이신과 두 개의 짧은 10 초 멸균 물이 5 분 긴 세척으로 된 커버를 씻는다. 하룻밤 라미닌 (0.01 ㎎ / ㎖)를 첨가하고, 가습 된 5 % CO 2 분위기 (CO 2 배양기)에서 37 ° С에서 품어. 70 % 에탄올로 해부 영역을 소독 및 곡선과 직선 조직 집게, 가위와 핀셋으로 해부 도구의 배열을 수집, 완전히 해부기구를 소독하기 위해 70 % 에탄올에 배치합니다. 그 뒷면에 CO 2 안락사 임신 한 쥐 / 마우스를 놓고 70 % 에탄올과의 복부 피부를 청소합니다. 내부 장기와 자궁을 공개, 핀셋으로 피부를 조이고 피부, 근육과 복막을 통해 복부 절단분명히 배아와. 자궁에서 배아 (E16-17)를 추출하고 냉장 PBS와 페트리 접시에 놓습니다. 층류 후드에서 배아를 놓고 냉장 HBSS로 새로운 배양 접시에 머리를 수집, 그들 목을 벨. 해부 현미경, 곡선과 직선 집게를 사용하여 뇌를 해부. 냉장 HBSS를 포함하는 새로운 배양 접시에 두뇌를 놓습니다. 두 대뇌 반구를 분리하고 조심스럽게 수막을 제거합니다. 해마의 선을 따라 잘라 선조체을 공개하는 피질을 벗겨. 반구의 전방에 가로 무늬 흰색 구조와 선조체 (striatum)을 준수하십시오. 선조체 (striatum)를 해부 매우 작은 조각으로 잘라 (1 – 직경 2 mm)의 1 ml의 총 부피와 멸균 15 ㎖의 원심 분리 관으로 자료를 수집하기 위해 화재 광택 파스퇴르 피펫을 사용합니다. 화재 연마 재료가 손상되지 않고 수집 보장합니다. 화재 연마 TI를 사용하여파스퇴르 피펫의 p는 세포를 흡인하고 그들에게 8 릴리스 – 10 회. 이 균질 나타날 때까지 6 회 – 원래의 직경 (1mm)의 약 30 %의 불 닦으 팁 새로운 펫을 가지고가는 것은, 해결책 추가 4 씹다. 신선한 멸균 원심 관에 100 ㎛ 나일론 세포 여과기를 사용하여 세포를 필터. 혈구와 세포를 세어, 24 웰 조직 배양 플레이트에 웰 당 신경 세포 배양액 500 ㎕를 세포에 70,000 접시. 우물 권리와 체외 (DIV)에서 14 일 동안 가습 된 5 % CO 2 분위기 (CO 2 배양기)에서 37 ° С에서 부화 왼쪽 선동. 후 7 일, 연결을 문화의 순도를 확인하고, 글 리아 세포가 존재하는 경우, 시토신 β-D-아라 비노 시드 추가 (아라-C를 5 μM) 우물 증식을 중지합니다. 이렇게하려면 각 우물에서 신경 세포의 배양 배지 (PH 7.4) 250 μL를 제거하고 신선한 매체의 250 μL 포함 추가ING 아라-C.주의! 아라-C는 자극이다. 5. 공동 문화 준비 신경 문화의 날 11 일, 코트 멸균 조건에서 폴리 -D- 라이신 (0.1 ㎎ / ㎖)와 6 웰 플레이트 및 가습 된 5 % CO 2 분위기 (CO 2 배양기)에서 37 ° С에서 하룻밤 배양한다. 다음날 (신경 세포 배양 12 일째), 과량의 폴리 D 라이신 대기음 소량 코팅 (항생제없이) 웰을 새로운 세포 배양 배지를 첨가하기 전에 멸균 수로 5 분 동안 웰을 2 배 짧게 배 씻어 매체에서 혈청. 조직 배양 플라스크 (T-75)에서 배양액을 기음. 칼슘 1 ㎖를 첨가하기 전에 PBS로 두 번 세포를 씻어 / Mg를 2+ -chelating 에이전트 EDTA 부드럽게 비 – 효소 적 세포 해리 (0.48 mm)이다. 티슈 플라스크의 바닥으로부터 이들을 분리 세포를 선동. (세포 배양 배지 10 ㎖를 추가이 같은 항생제) 형질 방해 할 수없는 멸균 원심 분리 튜브에 세포 및 장소 대기음. 저속 벤치 탑 원심 분리기를 이용하여 5 분 동안 440 XG에 세포 펠렛. 상등액을 제거하고 신선한 세포 배양 배지 1 ㎖로 세포를 재현 탁. 혈구를 사용하여 6 웰 플레이트에 웰 당 3 × 105 세포의 밀도로 세포 플레이트를 계산. 부드럽게 교반 및 가습 된 5 % CO 2 분위기 (CO 2 배양기)에서 37 ° С에서 24 시간 동안 배양한다. 다음 날 (신경 문화의 날 13) 일시적으로 리포좀 형질 전환 시약을 사용하여 pcDNA3 식 구조에 mCherry의 cDNA와 HEK293 세포를 형질. 간단히, 멸균 microcentrifuge 관에서, 감소 혈청 배지 500 μL 및 mCherry의 cDNA의 5 μg의를 추가합니다. 리포좀 버퍼링 시약 5 μl를 첨가하고, 온화하게 5 분 동안 실온에서 떠나기 전에 혼합한다. 리포좀 형질 reag의 8.75 μl를 추가엔트 부드럽게 30 분 동안 실온에서 떠나기 전에 혼합한다. (CO 2 인큐베이터) 전사 적가 웰 6- 웰 조직 배양 플레이트의 각 행 및 가습 된 5 % CO 2 분위기하에 37 ° С 부화 회 상하 microcentrifuge 관의 내용을 피펫. 다음날 (신경 세포 배양 14 일째), 6- 웰 각각으로부터 HEK293 세포 배양 배지를 흡인하고 PBS (pH 7.4의) 각 웰 짧게 두번 씻어. 칼슘의 300 μl를 추가 ㎎ / 2 + -chelating 에이전트 EDTA (0.48 mM의) 및 트립신 EDTA 200 μL (0.02-0.48 mM)을 잘 각 솔루션 및 5 분 동안 37 ° С에서 배양한다. 멸균 15 ml의 원심 분리 튜브에 세포를 웰 당 신선한 HEK293 세포 배양 배지 1 ㎖를 추가 (이 트립신을 소멸) 및 기음. 실온에서 5 분 동안 440 XG에 세포를 원심 분리 상층 액을 제거한다. 신경 세포 배양 배지 (pH 7.4의) 500 μL에 펠렛을 재현 탁. </ 리> 혈구를 사용하여 신경 세포를 함유하는 24 웰 조직 배양 플레이트에 웰 당 30,000 세포의 밀도로 세포 및 종자를 계산. 24 시간 동안 (CO 2 배양기를) 세포를 분산하고 가습 된 5 % CO 2 분위기에서 37 ° С에서 공동 문화를 배양 할 수있는 판을 선동. 시냅틱 연락처와 활동 6. 분석 공동 문화 23 시간 후, GABA 성 중간 가시 뉴런과 HEK293 세포에 형광 염료가 결합 방지 synaptotagmin 내강의 도메인 특정 항체의 활동에 의존 흡수하여 사이에 '활성'접촉의 형성 조사 (Cy5에를, 표 1 참조) . 참고 : 항체는 synaptotagmin의 내강 도메인에 대한 액세스를 얻을 것입니다에 시냅스 소포 루멘과 세포 외 공간 사이의 연속성이 때 결합하는. 이는 특히이 antib을 만드는 신경 전달 물질 방출시 발생활성 시냅스 터미널의 우수한 마커를 멜로디. 신경 세포 배지에서 1:50으로 희석 Cy5에 표지 마우스 항 – synaptotagmin 항체 (로 Neurobasal 매체, 산도 7.4)을 추가,에, 첫째로 신경 매체와의 공동 문화 (표 1 참조 매체, pH를 7.4로 Neurobasal)을 씻어 문화, 30 분. 가습 된 5 % CO 2 분위기에서 37 ° С에서이 시간 (CO 2 배양기) 동안 세포를 품어. 공동 문화를 씻어 항체의 액세스를 제거하기 위해 잠시 동안 세 번 : 첫 번째, 두 번째 차가운 PBS (PH 7.4), 200 mM의 NaCl을 함유하는, 차가운 정상 PBS로 세 번째 감기 정상 PBS (PH 7.4)와 (PH 7.4) 교반과 함께 10 분 동안 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드 / 4 % 자당의 300 μL (PFA, 산도 7.4)로 세포를 고정합니다. 두 개의 긴 10 분 세척과 함께 다음 PBS (PH 7.4) 짧게 두 번 세포를 씻으십시오. PFA을 해소하기 위해 교반과 함께 10 분 동안 잘 각각 글리신 (0.3 M)를 추가합니다. 세포를 씻으 brieflY 회 후 PBS (pH 7.4의) 두 이상 10 분 세척과의 비특이적 결합을 감소시키기 용액 (/ v)의 소 혈청 알부민 PBS에서 (BSA), pH 7.4의 승 1 % () 블로킹의 300 μl를 추가하기 전에 항체. 차단 솔루션을 대기음 기니피그에게 γ2 N- 말단 도메인 (33)에 대하여 지시 안티 GABA R-γ2 항체 추가 : 4 박 ° С에서 (1 PBS에서 3000, 산도 7.4). 다음 날, 우물에서 일차 항체를 기음과 두 개의 긴 10 분 세척과 함께 다음 PBS로 간단히 두 번 세포를 씻으십시오. 실온에서 30 분 동안 차단 용액에서 트리톤 X-100 (0.1 %)을 사용하여 세포를 Permeabilize 하시려면. 마우스 항 글루타민산 탈 탄산 효소를 첨가하기 전에 두 개의 긴 10 분 세척하여 후 PBS (pH 7.4의) 짧게 두 번 세포를 씻어 (GAD) 65 항체 (1 : 4000, 표 1) 또는 마우스 항 synapsin의 I 항체 ( 1 : 1,000, 방 t에서 120 분 표 1)칼 럼. 두 개의 긴 10 분으로 세척 한 후 PBS (pH 7.4의) 짧게 두 번 세포를 씻어 준 후 30 분 동안 실온에서 차단 용액에 추가. 원심 분리기에서 항체의 집계를 제거하는 (일반적으로 2 ㎍ / ㎖의에서 알렉사 플 루어 488 또는 염소 항 – 마우스 IgG 알렉사 플 루어 (405), 모든 접합 방지 기니 Cy5에 접합 돼지의 IgG, 염소 항 – 마우스 IgG를 염소) 적절한 보조 항체 차단 솔루션에 : 21910 10 분 동안 XG, 그리고 항체 (750 일)를 추가합니다. 1 시간 동안 우물을 적절한 빛 노출과 이에 따른 광표백에서 형광을 보호하기 위해 알루미늄 호일 커버에 적용됩니다. 마지막으로, 어떤 언 바운드 차 항체를 제거하고 장착 시약 (연장 골드, 표 1) 커버 슬립 당 약 10 μL를 사용 된 커버를 장착하는 두 개의 긴 10 분 세척과 함께 다음 PBS (PH 7.4) 짧게 두 번 세포를 씻으십시오. (4)에 전송하기 전에 빛으로부터 보호하면서 실온에서 24 시간 설정 허용장기 저장을 위해 С을 °. 63X 오일 침지 목적으로 레이저 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하여 샘​​플을 분석한다. 빛 수준을 확인하고, 검출기 이득이 포화를 방지하기 위해 조정됩니다. I 또는 Cy5에 표지 항 synaptotagmin synapsin GAD65에 대한 긍정적 인 시냅스 터미널, 및 DIC 또는 mCherry 형광 지시약으로 시각화 시냅스 HEK293 세포 사이의 공동 현지화의 지역 잠재적 인 시냅스와 같은 연락처를 관찰한다. 이미징 소프트웨어를 사용하여 셀 당 5 μm의 – (4)의 깊이를 통해 – 광학 부 (108)의 Z-스택 시리즈를 사용하여 시냅스 전위 형 콘택트 카운트.