Memeli salyangozunun bir çok sipariş karmaşık bir organdır. Fare, doğum sonrası erken aşamalarında otik gün E11 üzerinde vezikül ve gelişimsel programın tamamlanmasından itibaren ilkel iç kulağın ortaya çıkması arasında, hücre sinyal birden dalgaları ve gen ifadesi koordine değişiklikler gerçekleşir. Koklear kanalın doruk tabanından çalışan Corti duyusal epiteli, organ ya da tespit sesidir. Corti organı Kalkınma zarif gelişme sonunda, bu iç saç hücrelerinin tek bir satır oluşacaktır şekilde kontrol edilir, dış saç hücrelerinin üç sıra destek hücrelerin beş satır (sütun hücrelerin iki satır, üç serpiştirilmiş Deiters 'hücrelerin satır) ^1. , Işitme kaybı oluşumu ve duyusal epithemlium ² desenlendirme kesitler studye önemini heighlighting Bu kesin emir sonuçlarından sapma.

Embriyonik fare Coch in vitro kültür içindelea Corti organı gelişme mekanizmaları eğitim önemli bir araçtır. Bu teknik 1974 yılında kurulmuş ve son 40 yıldır, duyusal epitel belirtilen ve Corti organı ³ kurulduğu tarafından mekanizmaların birçok aydınlatmak için kullanılır olmuştur. Cochlea dinamik gelişim süreçleri ile karmaşık bir organdır; yedi gün ¹ tezahür olarak bir manipülasyon olarak uzun sürebilir. E13 bir koklear eksplant kültürü için GSK, 3β inhibitörlerin eklenmesi, örneğin,, en uygun kuluçka süresi bileşiğinin güçlü bir etkisi altı gün ⁴ gözlemlemek.

Gelişmekte Kokleanın Canlı görüntüleme Corti organı morfoloji değişiklikleri soruşturma verir, gen ifadesi değişiklikleri, göç ve izleme çoğalan veya hücreleri ölüyor, ve gerçek-zamanlı ilaç ajanların sonuçlarının gözlem ve sinyalizasyon bozulması sağlar yollar. Şimdiye kadar, Kokleanın Canlı görüntülemeyeağırlıklı olarak kısa süreler ^5-8 üzerinde Corti organı görüntü küçük alanlarda konfokal mikroskopi kullanılarak gerçekleştirilen, ancak bu tekniğin eksplant canlılığı nedeniyle sınırlamalar sahiptir. Yavaş gelişim süreçleri uzun süreli manipülasyon etkilerinin görüntülemede, görüntüleme ortamında çok önemlidir. Tipik bir konfokal canlı görüntüleme sistemi mikroskop oturur nemlendirilmiş bir plastik kutu kullanır. Isı ve nem gibi objektif veya ışık kaynağı olarak eklemli açıklıklar içinden ve microscope- çeşitli parçaları etrafında boşluklar aracılığıyla, erişim pencerelerden, mikroskop tablo uygun kuluçka kutusuna boşluklar kaçabilir. Bu fazla iki veya üç gün boyunca sağlıklı eksplantlarını korumak için optimal değildir.

Biz standart bir CO ₂ inkübatör içinde mühürlü bir ters mikroskop yerine mikroskop etrafında inşa edilen bir inkübatör olarak 'inkübatör mikroskop' tanımlar. Bir inkübatör mikroskop exDeneyin ömrünü uzatmaktadır yerine, iki veya üç gün boyunca görüntüleme daha, örnekler iki haftaya kadar süre için görüntülü şekildedir. Bir inkübatör mikroskop kültürleri ve standart kontrollü koşullar eksplantasyona minimal rahatsızlık, hücre büyümesi ve farklılaşması için mükemmel bir ortam sağlar. Birden fazla gün içinde yer alan çalışmalarda inkübatörden çıkardıktan ve bir ters flüoresan mikroskop bunları taşıyarak günlük olarak görüntüleme örneklere başvurmak olağandır. Bu yaklaşım işe iken, inkübatör bulaşıkları kaldırma duyarlı gelişmekte olan doku üzerinde stres uğratan. Nedeniyle inkübatörden çıkarıldıktan için sıcaklık kültürleme orta ve dalgalanmalar asit değişiklikleri optimal gelişim ve sağlıksız dokuya neden olabilir. Aynı odak düzlemi ve her zaman noktasında aynı yönde aynı bölgeyi görüntüleme son derece zordur. Bir inkübatör içinde otomatik bir sistem kullanılarak, sağlıklı sağlamak mümkündürdoku, daha fazla zaman noktalarında görüntüleri toplamak ve aynı alan her karede yakalanmasını sağlamak için. Son yıllarda birçok entegre mikroskop doku inkübatör, geliştirilen bu klinik pratikte ⁹ değil aynı zamanda kök hücre ve kanser araştırmalarında ^10,11 değil sadece yararlı olmuştur.

Burada embriyonik fare koklear eksplantlannın uzun vadeli canlı görüntüleme için bir protokol mevcut. Biz set zaman noktalarında çoklu numunelerin görüntüleri yakalamak için kapasitesine sahip standart bir CO ₂ inkübatör içinde otomatik bir mikroskop sistemi kullanın. Sistem, bir kuluçka makinesi içine yerleştirilmiş ters çevrilmiş bir mikroskop oluşur. Numuneler, her bir zaman noktasında çok sayıda örneğin görüntüleme sağlayan döner bir kürsü yerleştirilir. Aydınlatma, görüntü yakalama ve kürsünün dönme Metamorph yazılımı aracılığıyla işletilen otomatik bir sistem tarafından kontrol edilir. Işletim yazılımı kullanarak bir görüntüleme rutin ayarlayarak biz tw kadar aday için bir deney ayarlayabilirsinizen az insan müdahalesi ile o hafta. Bu örnekte biz özellikle büyük ölçekli büyüme ve koklea yeniden düzenlenmesini ve, prosensory bölgeyi göstermek için hem parlak bir alan ve floresan kullanın. Bu deneyde, cochleae. Embriyonik gün E13 üzerinde Sox2 ^EGFP muhabiri fareler disseke edilecektir In vitro kültürler kurulacak ve daha sonra beş gün içinde görüntülendi.