Live avbildning av embryonala däggdjur snäckan är en utmaning eftersom de utvecklingsprocesser till hands verkar på en tidsmässig lutning under tio dagar. Här presenterar vi en metod för odling och sedan avbilda embryonal cochlea explantat vävnad som tas från en fluorescerande reporter musen över fem dagar.
Här presenterar vi en metod för långsiktig tidsförlopp avbildning av levande embryonala mus cochlea explants. Det utvecklingsprogram ansvarig för att bygga den starkt ordnade, komplex struktur av däggdjurs cochlea intäkterna för cirka tio dagar. För att studera förändringar i genuttryck under denna period och deras reaktion på läkemedel eller genetisk manipulering, är nödvändiga långsiktiga avbildning. Tidigare har Bildproduktion typiskt begränsats av livskraft explanterad vävnad i en fuktig kammare ovanpå en vanlig mikroskop. Svårigheter att upprätthålla optimala förutsättningar för kultur tillväxt med avseende på luftfuktighet och temperatur har placerat gränser på hur lång avbildning experiment. Ett mikroskop integreras i en modifierad vävnadsodlingsinkubator ger en utmärkt miljö för långsiktig-levande avbildning. I denna metod visar vi hur man kan upprätta embryonala mus cochlea explants och hur man använder en inkubator mikroskop för att bedriva time lapse fantasinng med både ljusa fält och fluorescerande mikroskopi för att undersöka beteendet hos en typisk embryonala dag (E) 13 cochlea explant och Sox2, en markör av prosensory cellerna i snäckan, under 5 dagar.
Den däggdjurs snäckan är en mycket beställt komplext organ. I musen, mellan framväxten av den primitiva innerörat från öron vesikler på dag E11 och slutförande av utvecklings programmet vid första tiden efter födseln, flera vågor av cellsignalering och samordnade förändringar i genuttryck sker. Köra från bas till spets cochlea kanalen är ljudet upptäcka sensoriska epitel, eller organ Corti. Utveckling av organ Corti är utsökt kontrolleras så att i slutet av utvecklingen kommer det att bestå av en enda rad av inre hårceller, tre rader av yttre hårceller varvas med fem rader av stödjande celler (två rader av pelare celler, tre rader av Deiters 'celler) 1. Avvikelse från detta exakta order medför hörselnedsättning, heighlighting vikten av studye FATTAT uppkomst och mönstring av den sensoriska epithemlium 2.
In vitro odling av embryonala musen cochlea är ett viktigt verktyg för att studera mekanismerna för utvecklingen av organ Corti. Denna teknik grundades 1974 och under de senaste 40 åren, har använts för att belysa många av de mekanismer genom vilka den sensoriska epitelet specificeras och Cortis organ etablerade 3. Snäckan är ett komplext organ med dynamiska utvecklingsprocesser; en manipulation kan ta så länge som sju dagar att manifestera 1. Till exempel, när man lägger till GSK 3β inhibitorer till ett cochlea explantatet kulturen vid E13, den optimala inkubationstiden för att observera en stark effekt av föreningen är sex dagar 4.
Live avbildning av utvecklings snäckan medger undersökning förändringar i morfologi Cortis organ, förändringar i genuttryck, spårning av migrerande, förökar eller döende celler, och det tillåter realtid observation av resultaten av farmaceutiska medel och störning av signalering vägar. Hittills levande avbildning av snäckanhar främst utförts med hjälp av konfokalmikroskopi att avbilda små områden av Cortis organ under korta tidsperioder 5-8, men denna teknik har begränsningar på grund av explant livskraft. I avbildning av effekterna av långsiktiga manipulationer på långsamma utvecklingsprocesser, är bildmiljön avgörande. Typiskt en konfokala Bildproduktion system använder en fuktig plastlåda som sitter på mikroskopet. Värme och fukt kan komma ut genom luckorna i inkubation rutan där den möter mikroskopbordet, genom access fönstren, genom de svängbara öppningar och genom luckor runt olika delar av microscope- såsom målet eller ljuskällan. Detta är inte optimalt för en hälsosam explantat i mer än två eller tre dagar.
Vi definierar "kuvös mikroskop" som ett inverterat mikroskop förseglat inne i en standard CO2 inkubator, snarare än en inkubator byggd runt mikroskopet. En inkubator mikroskop extenderar livet av experimentet så att i stället för avbildning under två eller tre dagar, kan prover avbildas i upp till två veckor. En inkubator mikroskop ger en utmärkt miljö för celltillväxt och differentiering, med minimal störning till explantation kulturer och standardkontrollerade betingelser. I studier som sker över flera dagar är det vanligt att ta till avbildnings prover dagligen genom att ta bort dem från inkubatorn och transporterar dem till ett inverterat fluorescensmikroskop. Detta förhållningssätt kan arbeta, ta bort disken från inkubatorn fogar stress på känsliga utveckla vävnaden. Förändringar i surhetsgrad odlingsmediet och svängningar i temperaturen på grund av avlägsnande från inkubatorn kan resultera i suboptimal utveckling och ohälsosamt vävnad. Avbildning av samma region vid samma fokalplan och i samma orientering vid varje tidpunkt är extremt utmanande. Genom att använda ett automatiserat system inom en inkubator, är det möjligt att bevara friskavävnad, för att samla in bilderna vid flera tidpunkter och för att säkerställa att samma område fångas i varje ram. Under senare år har flera integrerade mikroskop vävnads inkubatorer har utvecklats, dessa har varit till nytta, inte bara i klinisk praxis 9 men också i stamcells och cancerforskning 10,11.
Här presenterar vi ett protokoll för långsiktig levande avbildning av embryonala mus cochlea explants. Vi använder en automatiserad mikroskope-system i en vanlig CO2 inkubator som har förmågan att ta bilder av flera prover vid inställda tidpunkter. Systemet består av ett inverterat mikroskop inställd inuti en inkubator. Proverna placeras i en roterande podium som tillåter avbildning av multipla prover vid varje tidpunkt. Belysning, bildfångst, och rotation av podiet styrs av ett automatiserat system drivs genom metamorfa programvara. Genom att sätta en avbildningsrutin med hjälp av operatörsprogrammet kan vi ställa ett experiment för att köra upp till two veckor med minimal mänsklig inblandning. I det här exemplet använder vi både ljusa fält och fluorescens för att visa storskalig tillväxt och omarrangemang av snäckan, och specifikt prosensory regionen. I detta experiment kommer hörselsnäckor dissekeras från Sox2 EGFP reporter möss på embryonala dag E13. In vitro kulturer kommer att upprättas och sedan avbildas under fem dagar.
Det finns flera tekniska punkter att tänka på när kulturer är etablerade och i upprättandet av tidsförlopp mikroskop för att långsiktigt avbildning.
Vi använder basalmembranmatris som ett substrat för odling av cochlea explantat, men substratet bör matchas till den celltyp. För att till exempel bild neuronala kulturer kan det vara bättre att ge en fibronektin beläggning. Inkubationstemperatur och gassammansättning bör också väljas beroende på vävnadstyp. Att välja en ål…
The authors have nothing to disclose.
Tack till Willy Sun för tekniskt stöd och Dr Kris Gellynck för värdefulla kommentarer och tre anonyma granskare för deras konstruktiva råd. Detta arbete har finansierats av Sunnybrook Hearing Regeneration Initiative
Dulbecco's Modified Eagle media | Gibco | 12430 | Multiple brands manufacture this | http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/classical-media/dmem.html |
Basement membrane extract | Corning | 354230 | Matrigel. Alternative similar products are available from other suppliers. http://catalog2.corning.com/Lifesciences/en-US/Shopping/Product.aspx?categoryname=Cell+Culture+and+Bioprocess%28Lifesciences%29|Extracellular+Matrix+Proteins+ECMs+and+Attachment+Factors%28Lifesciences%29|Matrigel+Basement+Membrane+Matrix+%28Lifesciences%29 |
|
Fetal bovine serum | Gibco | 16000044 | Multiple brands manufacture this http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=fbs&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete= |
|
HEPES | Gibco | 5630080 | Multiple brands manufacture this http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=hepes&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete= |
|
100 x N2 supplement | Gibco | 17502-048 | Multiple brands manufacture this http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=n2&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete= |
|
Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850-5G-F | Multiple brands manufacture this http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/17850?lang=en®ion=CA |
|
Hank's balanced salt solution | Gibco | 14170161 | Multiple brands manufacture this. Should be refidgerated before use. http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/balanced-salt-solutions/hbss-hanks-balanced-salt-solution.html?s_kwcid=AL!3652!3!26107410508!e!!g!!hbss&ef_id=xoFOglw2s UMAAMU8:20140228185720:s |
|
Fine Forceps | Fine Science tools | 11254-20 | Size number 5 http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=350&CategoryId=29 |
|
Curette | Fine Science Tools | 10080-05 | size 1 mm http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=91&CategoryId=118 |
|
Insect Pins | Fine Science Tools | 26001-35 | Must be stainless Steel http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=124 |
|
50 mm plastic dishes | Corning/Falcon | 351006 | Multiple brands manufacture this | |
charcoal | Sigma Aldrich | 05105-250G | Multiple brands manufacture similar items http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/05105?lang=en®ion=CA |
|
184 silicone elastomer | Dow/Corning | SYLGARD® 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dishes are home made several weeks in advance. Silicone elastomer can be from any supplier.http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291 | |
Glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-10-C | The dimensions of the dish are determined by the specifications of the imaging system. 35 mm diameter, 10mm well, number 0 coverslip fits Olympus Vivaview FL. http://glass-bottom-dishes.com/catalog/index.php?main_page=product_info&cPath= 1_4_15&products_id=2 |
|
Stereomicroscope | Zeiss | 495101-9804-000 | Stemi 2000 model. multiple brands manufacture similar items http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-2000.html |
|
Cold Light Source | Zeiss | 000000-1063-182 | Multiple brands manufacture similar items http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/microscope-components/lightsources.html |
|
Fluorescent Stereomicroscope | Leica microsystems | Contact Leica microsystems | Leica M165-FC. Multiple brands manufacture similar items http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-m165-fc/ |
|
Incubator Microscope +imaging software | Olympus | Contact Olympus | Inverted microcope sealed inside a Co2 incubator. Vivaview FL incubator microscope with proprietry Metamorpoh imaging software. http://olympuscanada.com/seg_section/product.asp?product=1055&c=0 |
|
Clean bench | Thermo Scientific | 51029701 | Multiple brands manufacture similar items http://www.thermoscientific.com/en/product/heraguard-eco-clean-bench.html |
|
CO2 incubator | Thermo Scientific | 3310 | Multiple brands manufacture similar items http://www.thermoscientific.com/en/products/co2-incubators.html |
|
Laminar Flow hood | Thermo Scientific | 51026651 | Multiple brands manufacture similar items http://www.thermoscientific.com/en/products/biological-safety-cabinets-clean-benches.html |