Het zoogdier cochlea is een sterk geordende complex orgaan. In de muis, tussen het ontstaan ​​van de primitieve binnenoor van de otic blaasje op dag E11 en de voltooiing van het ontwikkelingsprogramma in de vroege postnatale fase, verschillende golven van celsignalen en gecoördineerde veranderingen in genexpressie plaatsvindt. Loopt van de basis tot top van het cochleaire kanaal is het geluid detecteren zintuiglijke epitheel, of orgaan van Corti. Ontwikkeling van het orgaan van Corti is prachtig gestuurd dat eind ontwikkeling, zal het bestaan ​​uit een enkele rij binnenste haarcellen, drie rijen buitenste haarcellen afgewisseld met vijf rijen van steuncellen (twee rijen pijler cellen drie rijen cellen Deiters ') ^1. Afwijking van deze precieze volgorde leidt tot gehoorverlies, heighlighting het belang van studye Ofthe genese en patroonvorming van de zintuiglijke epithemlium ^2.

In vitro kweken van de embryonale muis Cochlea is een essentieel instrument in het bestuderen van de mechanismen van de ontwikkeling van het orgaan van Corti. Deze techniek werd in 1974 en in de afgelopen 40 jaar is gebruikt om veel van de mechanismen die de sensorische epitheel wordt gespecificeerd en het orgaan van Corti vastgestelde ³ helderen. De cochlea is een complex orgaan met dynamische ontwikkelingsprocessen; een manipulatie kan zo lang duren als zeven dagen te manifesteren ^1. Bijvoorbeeld, het toevoegen GSK 3β remmers een cochleair explantaatkweek op E13, de optimale incubatietijd observeren een robuust effect van de verbinding zes dagen ^4.

Levende beeldvorming van de ontwikkeling cochlea maakt onderzoek naar veranderingen in de morfologie van het orgaan van Corti, veranderingen in genexpressie, het volgen van migrerende prolifererende of stervende cellen en maakt real-time observatie van de resultaten van farmaceutische middelen en verstoring signalering trajecten. Tot nu, leeft beeldvorming van de cochleais voornamelijk uitgevoerd met behulp van confocale microscopie om het kleine gebieden van het orgaan van Corti in een kort tijdsbestek ^5-8, maar deze techniek heeft beperkingen als gevolg van explant levensvatbaarheid. In beeld brengen van de effecten op de langere termijn manipulaties op trage ontwikkelingsprocessen, de imaging omgeving is cruciaal. Typisch een confocale live beeldvorming systeem een ​​vochtige plastic doos die zit op de microscoop. Warmte en vocht kunnen door de spleten in het incuberen doos waar het de microscoop tafel, door de toegang ramen, door de scharnierende openingen en door de spleten rond verschillende delen van de microscope- ontsnappen als het doel of de lichtbron. Dit is niet optimaal voor het behoud van gezonde explantaten meer dan twee of drie dagen.

We definiëren 'incubator microscoop "als een omgekeerde microscoop verzegeld in een standaard _CO2 incubator, in plaats van een incubator rond de microscoop. Een incubator microscoop exneigt de levensduur van het experiment zodanig dat in plaats beeldvorming gedurende twee of drie dagen, monsters worden afgebeeld maximaal twee weken. Een incubator microscoop biedt een uitstekende omgeving voor celgroei en differentiatie, met minimale verstoring van culturen en standaard gecontroleerde omstandigheden explanteren. In studies die plaatsvinden over meerdere dagen is het gebruikelijk om gebruik te beeldvorming monsters dagelijks door ze te verwijderen uit de incubator en de uitvoering daarvan een geïnverteerde fluorescentiemicroscoop. Hoewel deze aanpak kan werken, het verwijderen van de gerechten uit de incubator toebrengt stress op de gevoelige ontwikkelen van weefsel. Veranderingen in de zuurgraad van het kweekmedium en schommelingen in de temperatuur als gevolg van verwijdering uit de incubator kan resulteren in een suboptimale ontwikkeling en ongezond weefsel. Beeldvorming hetzelfde gebied op dezelfde focal plane en in dezelfde richting op elk tijdstip is zeer uitdagend. Via een geautomatiseerd systeem in een incubator, kan men gezond houdenweefsel, om beelden te verzamelen op meer tijdstippen en ervoor te zorgen dat hetzelfde gebied zich in elk frame. In de afgelopen jaren verschillende geïntegreerde microscoop weefsel incubators zijn ontwikkeld, zijn deze nuttig niet alleen in klinische praktijk ⁹ maar ook in stamcellen en kankeronderzoek ^10,11.

Hier presenteren we een protocol voor de lange termijn live beeldvorming van embryonale muis cochleair explants. We maken gebruik van een geautomatiseerde microscopie-systeem in een standaard CO ₂ incubator die de mogelijkheid om beelden van meerdere monsters vastleggen op vaste tijdstippen heeft. Het systeem bestaat uit een omgekeerde microscoop set in een couveuse. Monsters worden geplaatst in een roterend podium die beeldvorming van meerdere monsters mogelijk maakt op elk tijdstip. Verlichting, het vastleggen van beelden, en de rotatie van het podium worden aangestuurd door een geautomatiseerd systeem bediend door Metamorph software. Door het instellen van een imaging routine met behulp van de besturingssoftware kunnen we een experiment ingesteld om te werken voor maximaal two weken met minimale menselijke tussenkomst. In dit voorbeeld worden zowel helderveld en fluorescentie grootschalige groei en herschikking van de cochlea, en specifiek de prosensory regio tonen. In dit experiment wordt cochleae ontleed uit Sox2 ^EGFP reporter muizen op embryonale dag E13. In vitro kweken worden opgezet en vervolgens gescand gedurende vijf dagen.