القوقعة الثدييات هي جهاز معقد أمر غاية. في الماوس، وبين ظهور الأذن الداخلية البدائية من الحويصلة الأذنية في يوم E11 والانتهاء من البرنامج التنموي في مراحل ما بعد الولادة المبكرة، موجات متعددة من الخلايا مما يشير الى والتغيرات في التعبير الجيني منسقة تحدث. يمتد من القاعدة إلى قمة القناة القوقعة هو صوت كشف ظهارة حسية، أو جهاز كورتي. تطوير جهاز كورتي يتم التحكم بشكل رائع بحيث بنهاية التطوير، وسوف تتكون من صف واحد من خلايا الشعر الداخلية، وثلاثة صفوف من خلايا الشعر الخارجي تتخللها خمسة صفوف من الخلايا الداعمة (صفين من خلايا عمود، ثلاثة صفوف من خلايا دايترس) ^1. الانحراف عن هذه النتائج الترتيب الدقيق في فقدان السمع، heighlighting أهمية studye إف تي إتش إي نشأة والزخرفة من epithemlium الحسية ^2.

زراعة في المختبر من كوتش الفأر الجنينيةليا هي أداة أساسية في دراسة آليات تطوير جهاز كورتي. تأسست هذه التقنية في عام 1974 وعلى مدى السنوات ال 40 الماضية، وقد استخدمت لتوضيح العديد من الآليات التي يتم من خلالها تحديد ظهارة حسية وجهاز كورتي إنشاء ^3. القوقعة هي جهاز معقد مع العمليات التنموية الحيوية. تلاعب قد تستغرق وقتا طويلا كما سبعة أيام في إظهار ^1. على سبيل المثال، عند إضافة مثبطات 3β GSK لثقافة يزدرع في قوقعة E13، فترة الحضانة المثلى لمراقبة تأثير قوي من المجمع هو ستة أيام ^4.

التصوير المباشر لتطوير القوقعة يسمح التحقيق في التغييرات في مورفولوجية جهاز كورتي، والتغيرات في التعبير الجيني، وتتبع للهجرة، المتكاثرة أو يموتون الخلايا، وأنه يسمح مراقبة الوقت الحقيقي من نتائج وكلاء الأدوية وتعطل الإشارات مسارات. حتى الآن، والتصوير من القوقعة العيشوقد أجريت أساسا باستخدام متحد البؤر المجهري لصورة مناطق صغيرة من جهاز كورتي على مدى فترات زمنية قصيرة ^5-8، ولكن هذه التقنية لديها قيود بسبب قابلية النباتى. في تصوير آثار التلاعب على المدى الطويل على العمليات التنموية بطيئة، والبيئة التصوير أمر بالغ الأهمية. وعادة ما يستخدم نظام التصوير الحي متحد البؤر مربع من البلاستيك مرطب الذي يجلس على المجهر. يمكن للحرارة والرطوبة الهروب من خلال الثغرات في مربع احتضان حيث يلتقي الجدول المجهر، من خلال النوافذ الوصول، من خلال فتحات يتوقف ومن خلال الفجوات حول أجزاء مختلفة من microscope- مثل الهدف أو مصدر الضوء. ليس هذا هو الأمثل للحفاظ على إإكسبلنتس صحية لأكثر من يومين أو ثلاثة أيام.

نحدد "المجهر حاضنة 'كما مجهر مقلوب مختومة داخل القياسية CO ₂ الحاضنة، بدلا من أن تكون حاضنة تتمحور حول المجهر. سابق المجهر الحاضنةيميل إلى الحياة من هذه التجربة بحيث بدلا من التصوير على مدى يومين أو ثلاثة أيام، والعينات ويمكن تصوير لمدة تصل إلى أسبوعين. يوفر المجهر حاضنة بيئة ممتازة لنمو الخلايا والتمايز، مع الحد الأدنى من اضطراب في يزدرع الثقافات والظروف القياسية التي تسيطر عليها. في الدراسات التي تجري على مدى عدة أيام ومن الشائع أن يلجأ إلى عينات التصوير بشكل يومي عن طريق نقلهم من الحاضنة وتحمل لهم المجهر الفلورسنت المقلوب. في حين أن هذا النهج يمكن أن تعمل، وإزالة الأطباق من الحاضنة ينزل الضغط على الأنسجة الحساسة النامي. التغيرات في حموضة المتوسطة زراعة والتقلبات في درجات الحرارة بسبب إزالة من الحاضنة يمكن أن يؤدي إلى تطوير الأمثل والأنسجة غير الصحية. تصوير نفس المنطقة في نفس المستوى البؤري وفي نفس التوجه في كل نقطة زمنية هي صعبة للغاية. باستخدام نظام آلي داخل حاضنة، فمن الممكن للحفاظ على صحة جيدةالأنسجة، لجمع الصور في المزيد من النقاط والوقت لضمان أن يتم التقاط نفس المنطقة في كل إطار. في السنوات الأخيرة تم تطوير عدة حاضنات متكاملة الأنسجة المجهر، وكانت هذه مفيدة ليس فقط في الممارسة السريرية ⁹ ولكن أيضا في الخلايا الجذعية وأبحاث السرطان ^10،11.

هنا نقدم بروتوكول للتصوير الحية على المدى الطويل الجنينية إإكسبلنتس الماوس القوقعة. نستخدم نظام المجهر الآلي داخل القياسية CO ₂ الحاضنة التي لديها القدرة على التقاط الصور من عينات متعددة في نقطة زمنية محددة. ويتكون النظام من مجهر مقلوب مجموعة داخل حاضنة. توضع العينات في المنصة الدوارة التي تتيح التصوير عينات متعددة في كل نقطة زمنية. يتم التحكم في الإضاءة، والتقاط الصور، وتناوب على المنصة من قبل النظام الآلي تعمل من خلال برنامج Metamorph. عن طريق وضع روتين التصوير باستخدام برنامج التشغيل نتمكن من تجربة لتشغيل لمدة تصل إلى TWس أسابيع مع الحد الأدنى من التدخل البشري. في هذا المثال يمكننا استخدام كل حقل مشرق ومضان لإظهار نمو واسع النطاق وإعادة ترتيب القوقعة، وتحديدا، في المنطقة prosensory. في هذه التجربة، سيتم تشريح قوقعة من Sox2 ^EGFP الفئران مراسل في يوم الجنينية E13. سيتم تأسيسها في المختبر الثقافات ومن ثم تصويرها على مدى خمسة أيام.