Pattedyr cochlea er en yderst ordnede komplekst organ. Hos mus, mellem fremkomsten af ​​den primitive indre øre fra den otisk vesikel på dag E11 og færdiggørelse af den udviklingsmæssige program på tidlige postnatale faser, flere bølger af cellesignalering og koordinerede ændringer i genekspression finde sted. Løb fra base til spidsen af ​​den cochlear kanal er lyden detektering sensoriske epithel eller organ Corti. Udvikling af organet for Corti er udsøgt styres således, at ved udgangen af ​​udvikling, vil det bestå af en enkelt række af indre hårceller, tre rækker af ydre hårceller spækket med fem rækker af understøttende celler (to rækker af søjle celler, tre rækker af Deiters 'celler) ^1. Afvigelse fra denne præcise rækkefølge resulterer i høretab, heighlighting betydningen af studye afde tilblivelse og mønstring af den sensoriske epithemlium ^2.

In vitro dyrkning af embryonale mus cochlea er et vigtigt redskab i at studere de mekanismer for udvikling af et organ under Corti. Denne teknik blev etableret i 1974 og i løbet af de sidste 40 år, er blevet brugt til at belyse mange af de mekanismer, som det sensoriske epithel er angivet, og det organ Corti etablerede ^3. Cochlea er et komplekst organ med dynamiske udviklingsprocesser; en manipulation kan tage så lang tid som syv dage, manifestere ^1. For eksempel, når tilsætning af GSK 3β inhibitorer til en cochlear eksplantat kultur på E13, den optimale inkubationstid at observere en robust virkningen af forbindelsen seks dage ^4.

Live-billeddannelse af det udviklende cochlea muliggør undersøgelse ændringer i morfologi af orglet af Corti, ændringer i genekspression, tracking af trækfugle, prolifererende eller døende celler, og det giver real-time observation af resultaterne af farmaceutiske midler og afbrydelse af signalering veje. Indtil nu lever billeddannelse af cochleaer hovedsagelig blevet udført under anvendelse konfokalmikroskopi til billedet små områder af det organ Corti over korte tidsperioder ^5-8, men denne teknik har begrænsninger på grund eksplantat levedygtighed. I billedbehandling af virkningerne af længerevarende manipulationer på langsomme udviklingsprocesser, imaging miljø er afgørende. Typisk en konfokal billeddannelse system bruger en fugtig plastboks, der sidder på mikroskopet. Varme og fugt kan slippe ud gennem hullerne i inkubere boks, hvor den møder mikroskop bordet, gennem adgang vinduerne, gennem de hængslede åbninger og gennem huller omkring forskellige dele af microscope- såsom formålet eller lyskilden. Dette er ikke optimal til at opretholde en sund eksplantater for mere end to eller tre dage.

Vi definerer "incubator mikroskop 'som et omvendt mikroskop forseglet i en standard CO _2-inkubator, snarere end en inkubator bygget omkring mikroskopet. En inkubator mikroskop extendens livet af forsøget, således at i stedet for billeddannelse over to eller tre dage, kan prøver afbildes i op til to uger. En inkubator mikroskop giver et glimrende miljø for cellevækst og differentiering, med minimal forstyrrelse eksplantatkulturer og standard kontrollerede forhold. I undersøgelser, der finder sted over flere dage er det almindeligt at ty til billeddannelse prøver dagligt ved at fjerne dem fra inkubatoren og transporterer dem til et omvendt fluorescerende mikroskop. Mens denne tilgang kan arbejde, fjerne retter fra inkubatoren påfører stress på følsomme udvikle væv. Ændringer i surhed af dyrkningsmediet og svingninger i temperatur på grund af fjernelse fra inkubatoren kan medføre suboptimal udvikling og usundt væv. Billeddannelse af samme region på samme fokale plan og i samme retning på hver tidspunkt er meget udfordrende. Ved anvendelse af et automatiseret system i en inkubator, er det muligt at opretholde en sundvæv, at indsamle billeder på flere tidspunkter og sikre, at det samme område er fanget i hver ramme. I de senere år er der udviklet flere integrerede mikroskop væv væksthuse, disse har været nyttig, ikke kun i klinisk praksis ^9, men også i stamceller og kræftforskning ^10,11.

Her præsenterer vi en protokol for langsigtet billeddannelse af embryonale mus cochleare eksplantater. Vi bruger en automatiseret mikroskopi-system inde i en standard CO ₂ inkubator, der har evnen til at tage billeder af flere prøver på indstillede tidspunkter. Systemet består af et omvendt mikroskop sæt inde i en inkubator. Prøverne anbringes i en roterende forhøjning, der tillader billeddannelse af multiple prøver ved hvert tidspunkt. Illumination, image capture og rotation af podiet styres af et automatiseret system, der drives gennem Metamorph software. Ved at sætte en billeddannende rutine ved hjælp af operativsystemet software kan vi sætte et eksperiment til at køre op til two uger med minimal menneskelig indgriben. I dette eksempel anvender vi både lysfelt og fluorescens til at vise store vækst og omlejring af cochlea, og specifikt prosensory region. I dette eksperiment, vil cochleae dissekeres fra Sox2 ^EGFP reporter mus på embryonale dag E13. In vitro-kulturer vil blive etableret, og derefter afbildes over fem dage.