La coclea dei mammiferi è un organo complesso altamente ordinato. Nel topo, tra l'emergere dell'orecchio interno primitiva vescicola otica del giorno E11 e il completamento del programma di sviluppo nelle fasi postnatali precoci, più ondate di segnalazione cellulare e cambiamenti coordinati nell'espressione genica hanno luogo. Esecuzione dalla base all'apice del condotto cocleare è il suono di rilevamento epitelio sensoriale, o l'organo del Corti. Sviluppo dell'organo del Corti è squisitamente controllato in modo tale che entro la fine dello sviluppo, che sarà composto da una sola fila di cellule ciliate interne, tre file di cellule ciliate esterne intervallate da cinque file di cellule di supporto (due file di celle pilastro, tre file di celle Deiters ') ^1. Deviazione da questo preciso ordine si traduce in perdita di udito, heighlighting l'importanza di studye Ofthe genesi e patterning del epithemlium sensoriale ^2.

In coltura in vitro del mouse Coch embrionalelea è uno strumento essenziale per lo studio dei meccanismi di sviluppo dell'organo del Corti. Questa tecnica è stata fondata nel 1974 e nel corso degli ultimi 40 anni, è stato utilizzato per chiarire molti dei meccanismi attraverso i quali è specificato l'epitelio sensoriale e l'organo del Corti stabilito ^3. La coclea è un organo complesso con processi di sviluppo dinamici; una manipolazione può richiedere fino a sette giorni per manifestare ^1. Ad esempio, quando si aggiunge inibitori GSK 3β ad una cultura espianto cocleare a E13, il periodo di incubazione ottimale per osservare un effetto robusto del composto è di sei giorni ^4.

Immagini dal vivo della coclea in via di sviluppo permette di indagine in cambiamenti nella morfologia dell'organo del Corti, cambiamenti di espressione genica, il monitoraggio di migrazione, proliferazione o morenti cellule, e permette l'osservazione in tempo reale dei risultati di agenti farmaceutici e la rottura di segnalazione percorsi. Fino ad ora, vivere l'imaging della cocleaè stata principalmente effettuata mediante microscopia confocale a immagini piccole aree dell'organo del Corti in periodi di tempo brevi ^5-8, ma questa tecnica ha dei limiti dovuti alla redditività espianto. Nelle immagini degli effetti delle manipolazioni a lungo termine sui processi evolutivi lenti, l'ambiente di imaging è cruciale. Tipicamente un sistema di imaging vivo confocale utilizza una scatola di plastica umidificata che siede sul microscopio. Calore e umidità possono sfuggire attraverso le fessure nella scatola incubazione dove incontra il tavolo microscopio, attraverso le finestre di accesso, attraverso le aperture a battente e attraverso le aperture intorno varie parti del Microscopio quali l'obiettivo o della sorgente luminosa. Questo non è ottimale per mantenere espianti sani per più di due o tre giorni.

Definiamo 'microscopio incubatore' come un microscopio invertito sigillato all'interno di un livello di CO ₂ incubatore, piuttosto che un incubatore costruito intorno al microscopio. Un microscopio incubatore extende la durata dell'esperimento tale che piuttosto che l'imaging in due o tre giorni, i campioni possono essere esposte per due settimane. Un microscopio incubatore fornisce un ottimo ambiente per la crescita cellulare e la differenziazione, con il minimo disturbo per espiantare le culture e le condizioni standard controllato. Negli studi che si svolgono su più giorni è comune ricorrere a campioni di imaging quotidianamente rimuovendoli dal termostato e li trasporta ad un microscopio a fluorescenza invertito. Anche se questo approccio può funzionare, di estrarre le stoviglie dal termostato infligge stress sul tessuto in via di sviluppo sensibile. Variazioni acidità del mezzo di coltura e le fluttuazioni di temperatura dovuto alla rimozione dal termostato può provocare lo sviluppo ottimale e tessuto sano. Imaging stessa regione nello stesso piano focale e nello stesso orientamento in ogni punto temporale è estremamente impegnativo. Utilizzando un sistema automatizzato all'interno di un incubatore, è possibile mantenere in buona salutetessuti, per raccogliere le immagini a più punti di tempo e di garantire che la stessa area viene catturato in ogni fotogramma. Negli ultimi anni sono stati sviluppati diversi incubatori tessuto microscopio integrati, questi sono stati utili non solo nella pratica clinica ⁹ ma anche in cellule staminali e cancro ricerche ^10,11.

Qui vi presentiamo un protocollo per il lungo termine l'imaging dal vivo di espianti embrionali del mouse cocleari. Usiamo un sistema di microscopia automatizzata all'interno di un incubatore CO ₂ standard che ha la capacità di catturare immagini di più campioni in momenti insieme. Il sistema è costituito da un microscopio invertito impostato all'interno di un incubatore. I campioni sono collocati in una pedana rotante che permette l'imaging di campioni multipli ad ogni tempo. Illuminazione, l'acquisizione di immagini e la rotazione della pedana sono controllati da un sistema automatico gestito tramite software Metamorph. Impostando una routine di imaging con il software operativo possiamo impostare un esperimento di correre per un massimo di two settimane con minimo intervento umano. In questo esempio si usa sia in campo chiaro e fluorescenza a mostrare una crescita su larga scala e riarrangiamento della coclea, e, in particolare, la regione prosensory. In questo esperimento, coclee verrà sezionato da Sox2 ^EGFP topi reporter del giorno embrionale E13. Sarà stabilita culture in vitro e poi ripreso nel corso di cinque giorni.