माउस Cochlear explants की लंबी अवधि के समय चूक इमेजिंग
Summary
हाथ में विकास की प्रक्रिया दस दिनों में एक अस्थायी ढाल पर संचालित क्योंकि भ्रूण स्तनधारी कोक्लीअ के लाइव इमेजिंग चुनौती दे रहा है. यहाँ हम पांच दिनों में एक फ्लोरोसेंट संवाददाता माउस से लिया भ्रूण कर्णावत explant ऊतक इमेजिंग फिर संवर्धन और के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं.
Abstract
यहाँ हम रहते भ्रूण माउस कर्णावत explants की लंबी अवधि के समय चूक इमेजिंग के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं. लगभग दस दिनों के लिए स्तनधारी कोक्लीअ आय का अत्यधिक आदेश दिया, जटिल संरचना के निर्माण के लिए जिम्मेदार विकास कार्यक्रम. इस अवधि में जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन और दवा या आनुवंशिक हेरफेर करने के लिए उनकी प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए, लंबे समय तक इमेजिंग आवश्यक है. इससे पहले, लाइव इमेजिंग आमतौर पर एक मानक माइक्रोस्कोप के ऊपर एक humidified कक्ष में explanted ऊतकों की व्यवहार्यता द्वारा सीमित किया गया है. नमी और तापमान के संबंध में संस्कृति के विकास के लिए इष्टतम स्थितियों को बनाए रखने में कठिनाई इमेजिंग प्रयोगों की लंबाई पर सीमा रखा गया है. एक संशोधित टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में एकीकृत एक माइक्रोस्कोप दीर्घकालिक-रहते इमेजिंग के लिए एक शानदार वातावरण प्रदान करता है. इस विधि में हम भ्रूण माउस कर्णावत explants स्थापित करने के लिए कैसे और समय व्यतीत हो imagi संचालन करने के लिए एक मशीन माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए कैसे प्रदर्शितएनजी 5 दिनों में एक ठेठ भ्रूण दिन (ई) 13 कर्णावत explant और Sox2, कोक्लीअ के prosensory कोशिकाओं के एक मार्कर के व्यवहार की जांच करने के उज्ज्वल क्षेत्र और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी दोनों का उपयोग कर.
Introduction
स्तनधारी कोक्लीअ एक अत्यधिक आदेश दिया जटिल अंग है. माउस में, जल्दी प्रसव के बाद के चरणों में कान का दिन E11 पर पुटिका और विकास कार्यक्रम के पूरा होने से आदिम भीतरी कान के उद्भव के बीच, सेल संकेतन के कई तरंगों और जीन अभिव्यक्ति में समन्वित परिवर्तन जगह ले. कर्णावत वाहिनी के शीर्ष करने के लिए बेस से चल रहा है Corti के संवेदी उपकला, या अंग का पता लगाने ध्वनि है. Corti के अंग का विकास उत्कृष्ट विकास के अंत तक, यह भीतरी बालों की कोशिकाओं का एक ही पंक्ति से मिलकर बनता है कि इस तरह से नियंत्रित किया जाता है, बाहरी बालों की कोशिकाओं की तीन पंक्तियों का समर्थन कोशिकाओं के पांच पंक्तियों (स्तंभ कोशिकाओं की दो पंक्तियाँ, तीन के साथ interspersed Deiters 'कोशिकाओं की पंक्तियाँ) 1. , हानि सुनवाई उत्पत्ति और संवेदी epithemlium 2 की patterning यापन करने studye के महत्व heighlighting में इस सटीक क्रम परिणामों से विचलन.
भ्रूण माउस Coch की इन विट्रो संवर्धन मेंघास का मैदान Corti के अंग के विकास के तंत्र के अध्ययन में एक अनिवार्य उपकरण है. इस तकनीक को 1974 में स्थापित किया गया था और पिछले 40 वर्षों में, संवेदी उपकला निर्दिष्ट और Corti के अंग 3 की स्थापना की है जिसके द्वारा तंत्र के कई स्पष्ट करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. कोक्लीअ गतिशील विकास की प्रक्रिया के साथ एक जटिल अंग है; सात दिन 1 प्रकट करने के रूप में एक जोड़-तोड़ के रूप में लंबे समय लग सकता है. E13 पर एक कर्णावत explant संस्कृति को जीएसके 3β अवरोधकों जोड़ने जब उदाहरण के लिए, इष्टतम ऊष्मायन अवधि परिसर के एक मजबूत प्रभाव छह दिन 4 निरीक्षण करने के लिए.
विकासशील कोक्लीअ के लाइव इमेजिंग Corti के अंग की आकृति विज्ञान में परिवर्तन की जांच की अनुमति देता है, जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन, पलायन की ट्रैकिंग proliferating या कोशिकाओं मर रहा है, और यह वास्तविक समय दवा एजेंटों के परिणामों का अवलोकन और संकेत के विघटन की अनुमति देता है रास्ते. अब तक, कोक्लीअ की इमेजिंग रहते हैंमुख्य रूप से कम समय अवधि 5-8 से अधिक Corti के अंग की छवि छोटे क्षेत्रों को confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया है, लेकिन इस तकनीक explant व्यवहार्यता के कारण सीमाएँ किया गया है. धीमी गति से विकास की प्रक्रिया पर लंबी अवधि के जोड़तोड़ के प्रभाव की इमेजिंग में, इमेजिंग माहौल महत्वपूर्ण है. आमतौर पर एक confocal रहते इमेजिंग प्रणाली माइक्रोस्कोप पर बैठता है कि एक humidified प्लास्टिक बॉक्स का उपयोग करता है. गर्मी और उमस ऐसी उद्देश्य या प्रकाश स्रोत के रूप में यह hinged उद्घाटन के माध्यम से और microscope- के विभिन्न भागों के आसपास अंतराल के माध्यम से, पहुँच खिड़कियों के माध्यम से, माइक्रोस्कोप तालिका से मिलता है जहां incubating बॉक्स में अंतराल के माध्यम से बच सकते हैं. यह अधिक से अधिक दो या तीन दिनों के लिए स्वस्थ explants को बनाए रखने के लिए इष्टतम नहीं है.
हम एक मानक सीओ 2 इनक्यूबेटर अंदर सील एक औंधा माइक्रोस्कोप, बजाय खुर्दबीन के आसपास का निर्माण एक मशीन के रूप में 'इनक्यूबेटर माइक्रोस्कोप' को परिभाषित. एक मशीन माइक्रोस्कोप पूर्वप्रयोग के जीवन आदत नहीं बल्कि दो या तीन दिनों में इमेजिंग से, नमूने के लिए दो सप्ताह के लिए imaged किया जा सकता है कि इस तरह के. एक मशीन माइक्रोस्कोप संस्कृतियों और मानक नियंत्रित परिस्थितियों explant को न्यूनतम अशांति के साथ, सेल के विकास और भेदभाव के लिए एक शानदार वातावरण प्रदान करता है. कई दिनों से अधिक जगह ले कि अध्ययन में यह इनक्यूबेटर से उन्हें हटाने और एक औंधा फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के लिए उन्हें ले जाने से एक दैनिक आधार पर इमेजिंग नमूनों का सहारा आम है. इस दृष्टिकोण से काम कर सकते हैं, इनक्यूबेटर से व्यंजन हटाने संवेदनशील विकासशील ऊतक पर तनाव inflicts. कारण इनक्यूबेटर से हटाने के लिए तापमान में संवर्धन मध्यम और उतार चढ़ाव की अम्लता में परिवर्तन suboptimal विकास और अस्वस्थ ऊतक में परिणाम कर सकते हैं. एक ही फोकल हवाई जहाज़ पर और हर समय बिंदु पर एक ही अभिविन्यास में एक ही क्षेत्र इमेजिंग बेहद चुनौतीपूर्ण है. एक मशीन के भीतर एक स्वचालित प्रणाली का उपयोग करके, यह स्वस्थ बनाए रखने के लिए संभव हैऊतक, अधिक समय बिंदुओं पर छवियों को इकट्ठा करने के लिए और एक ही क्षेत्र हर फ्रेम में कब्जा कर लिया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए. हाल के वर्षों में कई एकीकृत माइक्रोस्कोप ऊतक इन्क्यूबेटरों, विकसित किया गया है इन क्लिनिकल प्रैक्टिस 9 में, लेकिन यह भी स्टेम सेल और कैंसर अनुसंधान 10,11 में न केवल उपयोगी किया गया है.
यहाँ हम भ्रूण माउस कर्णावत explants के दीर्घकालिक लाइव इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. हम निर्धारित समय बिंदुओं पर कई नमूने की छवियों पर कब्जा करने की क्षमता है कि एक मानक सीओ 2 इनक्यूबेटर अंदर एक स्वचालित माइक्रोस्कोपी प्रणाली का उपयोग करें. प्रणाली एक मशीन के अंदर सेट एक औंधा माइक्रोस्कोप के होते हैं. नमूने हर समय बिंदु पर कई नमूनों की इमेजिंग की अनुमति देता है कि एक घूर्णन मंच में रखा जाता है. रोशनी, छवि पर कब्जा, और मंच के रोटेशन Metamorph सॉफ्टवेयर के माध्यम से संचालित एक स्वचालित प्रणाली द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं. ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एक इमेजिंग दिनचर्या निर्धारित करके हम TW अप करने के लिए चलाने के लिए एक प्रयोग सेट कर सकते हैंन्यूनतम मानवीय हस्तक्षेप के साथ ओ सप्ताह. इस उदाहरण में हम विशेष रूप से बड़े पैमाने पर विकास और कोक्लीअ के पुनर्निर्माण, और, prosensory क्षेत्र दिखाने के लिए दोनों उज्ज्वल क्षेत्र और प्रतिदीप्ति का उपयोग करें. इस प्रयोग में, cochleae. भ्रूण दिन E13 पर Sox2 EGFP संवाददाता चूहों से विच्छेदित किया जाएगा इन विट्रो संस्कृतियों की स्थापना की जाएगी और उसके बाद पांच दिनों में imaged.
Protocol
Representative Results
Discussion
संस्कृतियों की स्थापना की और दीर्घकालिक इमेजिंग के लिए आदेश में समय चूक माइक्रोस्कोप स्थापित करने में कर रहे हैं जब विचार करने के लिए कई तकनीकी बातें हैं.
हम कर्णावत explants संवर्धन के लिए एक सब?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
सहायक टिप्पणियों और उनके रचनात्मक सलाह के लिए तीन अनाम समीक्षक के लिए तकनीकी सहायता के लिए विली सूर्य और डॉ क्रिस Gellynck करने के लिए धन्यवाद. इस काम Sunnybrook सुनवाई पुनर्जनन पहल द्वारा वित्त पोषित किया गया
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle media | Gibco | 12430 | Multiple brands manufacture this | http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/classical-media/dmem.html |
| Basement membrane extract | Corning | 354230 | Matrigel. Alternative similar products are available from other suppliers. http://catalog2.corning.com/Lifesciences/en-US/Shopping/Product.aspx?categoryname=Cell+Culture+and+Bioprocess%28Lifesciences%29|Extracellular+Matrix+Proteins+ECMs+and+Attachment+Factors%28Lifesciences%29|Matrigel+Basement+Membrane+Matrix+%28Lifesciences%29 |
|
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000044 | Multiple brands manufacture this http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=fbs&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete= |
|
| HEPES | Gibco | 5630080 | Multiple brands manufacture this http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=hepes&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete= |
|
| 100 x N2 supplement | Gibco | 17502-048 | Multiple brands manufacture this http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=n2&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete= |
|
| Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850-5G-F | Multiple brands manufacture this http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/17850?lang=en®ion=CA |
|
| Hank's balanced salt solution | Gibco | 14170161 | Multiple brands manufacture this. Should be refidgerated before use. http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/balanced-salt-solutions/hbss-hanks-balanced-salt-solution.html?s_kwcid=AL!3652!3!26107410508!e!!g!!hbss&ef_id=xoFOglw2s UMAAMU8:20140228185720:s |
|
| Fine Forceps | Fine Science tools | 11254-20 | Size number 5 http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=350&CategoryId=29 |
|
| Curette | Fine Science Tools | 10080-05 | size 1 mm http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=91&CategoryId=118 |
|
| Insect Pins | Fine Science Tools | 26001-35 | Must be stainless Steel http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=124 |
|
| 50 mm plastic dishes | Corning/Falcon | 351006 | Multiple brands manufacture this | |
| charcoal | Sigma Aldrich | 05105-250G | Multiple brands manufacture similar items http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/05105?lang=en®ion=CA |
|
| 184 silicone elastomer | Dow/Corning | SYLGARD® 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dishes are home made several weeks in advance. Silicone elastomer can be from any supplier.http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-10-C | The dimensions of the dish are determined by the specifications of the imaging system. 35 mm diameter, 10mm well, number 0 coverslip fits Olympus Vivaview FL. http://glass-bottom-dishes.com/catalog/index.php?main_page=product_info&cPath= 1_4_15&products_id=2 |
|
| Stereomicroscope | Zeiss | 495101-9804-000 | Stemi 2000 model. multiple brands manufacture similar items http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-2000.html |
|
| Cold Light Source | Zeiss | 000000-1063-182 | Multiple brands manufacture similar items http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/microscope-components/lightsources.html |
|
| Fluorescent Stereomicroscope | Leica microsystems | Contact Leica microsystems | Leica M165-FC. Multiple brands manufacture similar items http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-m165-fc/ |
|
| Incubator Microscope +imaging software | Olympus | Contact Olympus | Inverted microcope sealed inside a Co2 incubator. Vivaview FL incubator microscope with proprietry Metamorpoh imaging software. http://olympuscanada.com/seg_section/product.asp?product=1055&c=0 |
|
| Clean bench | Thermo Scientific | 51029701 | Multiple brands manufacture similar items http://www.thermoscientific.com/en/product/heraguard-eco-clean-bench.html |
|
| CO2 incubator | Thermo Scientific | 3310 | Multiple brands manufacture similar items http://www.thermoscientific.com/en/products/co2-incubators.html |
|
| Laminar Flow hood | Thermo Scientific | 51026651 | Multiple brands manufacture similar items http://www.thermoscientific.com/en/products/biological-safety-cabinets-clean-benches.html |
Referências
- Wu, D. K., Kelley, M. W. Molecular mechanisms of inner ear development. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 4, (2012).
- Shim, K. The auditory sensory epithelium: the instrument of sound perception. The international journal of biochemistry & cell biology. 38, 1827-1833 (2006).
- Van de Water, T., Ruben, R. J. Growth of the inner ear in organ culture. The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 83, 1-16 (1974).
- Jacques, B. E., et al. A dual function for canonical Wnt/beta-catenin signaling in the developing mammalian cochlea. Development. 139, 4395-4404 (2012).
- Castellano-Munoz, M., Peng, A. W., Salles, F. T., Ricci, A. J. Swept field laser confocal microscopy for enhanced spatial and temporal resolution in live-cell imaging. Microscopy and microanalysis : the official journal of Microscopy. Society of America, Microbeam Analysis Society, Microscopical Society of Canada. 18, 753-760 (2012).
- Szarama, K. B., Gavara, N., Petralia, R. S., Chadwick, R. S., Kelley, M. W. Thyroid hormone increases fibroblast growth factor receptor expression and disrupts cell mechanics in the developing organ of corti. BMC developmental biology. 13, 6 (2013).
- Appler, J. M., et al. Gata3 is a critical regulator of cochlear wiring. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3679-3691 (2013).
- Wibowo, I., Pinto-Teixeira, F., Satou, C., Higashijima, S., Lopez-Schier, H. Compartmentalized Notch signaling sustains epithelial mirror symmetry. Development. 138, 1143-1152 (2011).
- Hashimoto, S., Kato, N., Saeki, K., Morimoto, Y. Selection of high-potential embryos by culture in poly(dimethylsiloxane) microwells and time-lapse imaging. Fertility and sterility. 97, 332-337 (2012).
- Matsuoka, F., et al. Morphology-based prediction of osteogenic differentiation potential of human mesenchymal stem cells. PloS one. 8, (2013).
- Ma, G. F., et al. et al.Transforming growth factor-beta1 and -beta2 in gastric precancer and cancer and roles in tumor-cell interactions with peripheral blood mononuclear cells in vitro. PloS one. 8, (2013).
- Taranova, O. V., et al. SOX2 is a dose-dependent regulator of retinal neural progenitor competence. Genes & development. 20, 1187-1202 (2006).
- Chen, P., Segil, N. p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti. Development. , 1581-1590 (1999).
