Grootschalige de zebravis embryonale Hart Dissection voor Transcriptionele Analyse
Summary
Cardiale genexpressie profielen te analyseren tijdens zebravis ontwikkeling van het hart, heeft totaal RNA worden geëxtraheerd uit geïsoleerde harten. Hier presenteren we een protocol voor het verzamelen van functionele / kloppende harten door snelle handmatige dissectie van de zebravis embryo's tot cardiale-specifieke mRNA te verkrijgen.
Abstract
De zebravis embryonale hart is samengesteld uit slechts een paar honderd cellen, die slechts een klein deel van de gehele embryo. Daarom, om de cardiale transcriptoom van wordt gemaskeerd door het wereldwijde embryonale transcriptoom voorkomen, moet voldoende harten voor verdere analyse te verzamelen. Zoals zebravis hartontwikkeling snel verloopt, hart inzameling en RNA winningsmethoden moet snel zijn om de homogeniteit van de monsters te verzekeren. Hier presenteren we een snelle handleiding dissectie protocol voor het verzamelen van functionele / kloppende harten van de zebravis embryo's. Dit is een essentiële voorwaarde voor verdere cardiaal-specifieke RNA-extractie cardiale genexpressie te bepalen door transcriptoom analyse, zoals kwantitatieve real-time polymerase-kettingreactie (RT-qPCR). De methode is gebaseerd op differentiële klevende eigenschappen van de zebravis embryonale hart in vergelijking met andere weefsels; Dit maakt een snelle PHYsieke scheiding van cardiale van extracardiale weefsel door een combinatie van vloeibare dwarskracht verstoring stapsgewijze filtratie en handmatige verzameling van transgene fluorescent gelabelde harten.
Introduction
Zebravis (Danio rerio) wordt veel gebruikt in ontwikkelingsbiologie in organogenese in vivo te bestuderen vanwege zijn snelle, transparante en buitenbaarmoederlijke embryonale ontwikkeling, in combinatie met de geringe omvang en de beschikbaarheid van transgene reporter lijnen met weefsel-specifieke expressie van fluorescerende eiwitten. Dit kleine gewervelde is bijzonder geschikt voor hartontwikkeling studeren, omdat oxygenatie van de vroege zebravis embryo niet afhankelijk hartslag en bloedstroom; Deze functies zijn toegelaten de karakterisering van grote aantallen cardiovasculaire mutanten 1,2 en de zebravis is nu algemeen erkend modelorganisme hartziekten 3 bestuderen.
Om de genexpressie te bestuderen tijdens de embryonale ontwikkeling, zijn transcripties vaak geanalyseerd door geheel-mount in situ hybridisatie (WISH) 4, RT-qPCR 5, microarrays 6, of next generation sequencing (RNA-Seq) 7. TerwijlWISH kan een ruimtelijk-temporele analyse van genexpressie in het gehele embryo worden transcript niveaus gewoonlijk bepaald door RT-qPCR, microarrays of RNA-Seq benaderingen. Deze werkwijzen vereisen weefsel verrijking voor genexpressie profilering.
Omdat het zebravis embryonale hart slechts een klein deel van de gehele embryo, transcriptoom studies gedurende cardiale ontwikkeling vereist een protocol voor dissectie en verrijking van harten. Bovendien fysiologisch relevante gegevens te verkrijgen, is het belangrijk om de cardiale weefsel volledig functioneel tot RNA-extractie behouden. We beschrijven hier een protocol voor het snel isoleren fysiologisch normaal en kloppende harten van honderden zebravis embryo's van hoge kwaliteit RNA monsters efficiënt te krijgen voor verdere analyses. De onderhavige werkwijze is gebaseerd op het protocol beschreven door Burns en MacRae, 2006 8. Voor verrijking van hartweefsel beide methoden een transgene myocardiale reporter lijnen profiteer van de differentiële hechting eigenschappen van de zebravis embryonale harten versus andere weefsels. Kort pipetteren veel embryo en neer door een smalle pipetpunt, harten gelijktijdig vrijkomen uit embryonale organen en vervolgens gescheiden uit embryonale puin in twee stappen snel filtreren; fluorescent gelabelde harten worden vervolgens handmatig gesorteerd blijft vuil en verzameld voor verdere verwerking.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol maakt de snelle verrijking van de zebravis embryonale hartweefsel voor genexpressie analyses. De kwantiteit en kwaliteit van de cardiale-specifieke RNA-monster is sterk afhankelijk van een aantal cruciale stappen: eerst wordt de hoeveelheid van het monster sterk verbeterd als het verlies van de harten wordt voorkomen bij elke stap van het protocol, omdat RNA zuivering werkt alleen met voldoende uitgangsmateriaal. Ten tweede, de zuiverheid van het monster, die volledig afhankelijk is van de experimentator, w…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank C. Burns, C. McRae for outlining the basic principle of this purification protocol, and F. Priller for initial implementation of this method in our lab. S.A.-S. is supported by a Heisenberg professorship of the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). This work was supported by DFG grant SE2016/7-1.
Materials
| Equipment for raising fish and collecting eggs | see the Zebrafish Book11 for details | ||
| Fluorescence stereomicroscope | |||
| Refrigerated Microcentrifuge | |||
| UV-Spectrophotometer | eg. Thermo Scientific Nanodrop 2000 | ||
| Nucleic acid electrophoresis chamber | |||
| Petri dishes 4cm Ø, coated with 1% agarose in E3 medium | |||
| Micropipettes and tips (P20, P100, P1000) | |||
| 1,5ml centrifugation tubes | |||
| 15ml and 50ml centrifugation tubes | |||
| Pair of Dumont #5 forceps | |||
| ExactaCruz™ Round Gel Loading Tips in Sterile Rack, 1-200μl | Santa Cruz | sc-201732 | |
| 100 μm filter (BD Falcon 100 mm Cell Strainer) | BD Biosciences | 352360 | |
| 30 μm filter (Pre-Separation Filters-30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Phase lock gel, heavy, 1,5ml tubes | Prime | 2302810 | |
| Egg water medium | 60μg/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH2O, 0.00001% (w/v) Methylene Blue | ||
| E3 medium | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | ||
| Tricaine (3-amino benzoic acidethylester) | Sigma-Aldrich | A-5040 | 4mg/ml Tricaine stock solution, pH 7 |
| 1% agarose (in E3 medium) | |||
| 1% agarose gel (in TBE buffer) | |||
| Leibovitz´s L-15 medium | Gibco | 21083-027 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma | F4135 | |
| RNAlater | Ambion | AM7020 | |
| Trizol | Ambion | 1559606 | |
| Glycogen | Invitrogen | 10814-010 | 20 µg/µL in RNase-free water |
| chloroform | |||
| isopropanol | |||
| 75% ethanol (in DEPC-ddH2O) | |||
| Nuclease-free water or sterilized DEPC treated ddH2O | |||
| Nucleic acid loading buffer | |||
| TBE (Tris/Borate/EDTA) buffer for electrophoresis |
Referências
- Stainier, D. Y., et al. Mutations affecting the formation and function of the cardiovascular system in the zebrafish embryo. Development. 123, 285-292 (1996).
- Chen, J. N., et al. Mutations affecting the cardiovascular system and other internal organs in zebrafish. Development. 123, 293-302 (1996).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc Res. 91, 279-288 (2011).
- Jowett, T., Lettice, L. Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes. Trends Genet. 10, 73-74 (1994).
- Gibson, U. E., Heid, C. A., Williams, P. M. A novel method for real time quantitative RT-PCR. Genome Res. 6, 995-1001 (1996).
- Epstein, C. B., Butow, R. A. Microarray technology – enhanced versatility, persistent challenge. Curr Opin Biotechnol. 11, 36-41 (2000).
- Qian, X., Ba, Y., Zhuang, Q., Zhong, G. RNA-Seq Technology and Its Application in Fish Transcriptomics. OMICS. 18, 98-110 (2014).
- Burns, C. G., MacRae, C. A. Purification of hearts from zebrafish embryos. Biotechniques. 40, 274-278 (2006).
- Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Veerkamp, J., et al. Unilateral dampening of Bmp activity by nodal generates cardiac left-right asymmetry). Dev Cell. 24, 660-667 (2013).
- Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
- Brownlie, A., et al. Characterization of embryonic globin genes of the zebrafish. Dev Biol. 255, 48-61 (2003).
- Marvin, M., et al. Developmental expression patterns of the zebrafish small heat shock proteins. Dev Dyn. 237, 454-463 (2008).
- Lam, C. S., Marz, M., Strahle, U. gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish brain. Dev Dyn. 238, 475-486 (2009).
- Wang, Y., et al. Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis. Development. 137, 3119-3128 (2010).
- Heiman, M., et al. A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types. Cell. 135, 738-748 (2008).
- Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish. Genesis. 51, 187-192 (2013).
