Kullanımı Geleneksel Hikaye ve Roman Yerleşimi Sistemleri: Plak Tahliller sayesinde viral Konsantrasyon Tayini
Summary
Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.
Abstract
Plak deneyleri, hücre kültüründe ayrı plaklar (bulaşıcı birimleri ve hücresel ölü bölgeler) olarak sayma ile bulaşıcı Virionlar ve antiviral maddelerin doğrudan ölçümü için en doğru yöntemlerden biri olmaya devam etmektedir. Burada biz bir temel plak deneyi gerçekleştirmek için nasıl göstermek, ve ayrılan bindirmeleri ve teknikleri plak oluşumunu ve üretimini etkileyebilir nasıl. Tipik haliyle, örneğin agaroz ya da karboksimetil selüloz gibi bir katı veya yarı-katı katlamalı alt-tabakalar, likit büyüme ortam içinden geçerek gelişigüzel enfeksiyonun önlenmesi, viral yayılmayı sınırlandırmak için kullanılmaktadır. Hareketsizleştirilmiş kaplamalar ayrık sayılabilir odakları ve daha sonra, plak oluşumunun oluşumuna izin hemen saran tek tabaka hücresel enfeksiyonu kısıtlar. Geleneksel kapaklar kullanıldığında doğasında zorlukların üstesinden gelmek için, mikrokristalin selüloz ve karboksimetil selüloz sodyum kullanan yeni bir sıvı kaplama artan standart bir yedek olarak kullanılmaktadırplak deneyi. Sıvı bindirme plak tahlilleri kolayca geleneksel tekniklerine göre standart 6 veya 12 sıra plaka biçimlerinden birinde yapılan ve hiçbir özel ekipman gerektirmez edilebilir. Nedeniyle sıvı bir halde ve uygulanması ve kaldırılması daha sonra çok kolay olduğu için mikro-plak formatlarını alternatif büyük ölçekli bir viral titrasyon için, doğru, hızlı ve yüksek kapasiteli bir alternatif olarak kullanılabilir. Isıtılmayan viskoz sıvı polimer kullanımı, çalışmalarını düzene fırsatı sunuyor reaktifleri, kuluçka alanı, ve hiçbir reaktif ısıtma veya cam gibi geleneksel ya da yüksek tutma laboratuvarlarında kullanılan operasyonel güvenlik gereklidir artar korur. Sıvı bindirmeleri de belirli ısıya dayanıksız virüsler için geleneksel bindirmeleri daha duyarlı ispat edebilir.
Introduction
Canlı viral örneklerin doğru izolasyon ve miktar tutarlı viroloji devam eden bir araştırma hedefi olmuştur. İlk 1,2 geliştirilen bir araç nicelik ve nitelik hayvan viral titreleri hesaplamak için 1952 yılında plak denemesinin gelişiyle kadar değildi. Bu teknik ilk olarak adapte ve daha önce bitki biyolojisi 1,2 stok bakteriyofajların titreleri hesaplamak için kullanılır olmuştu faj deneyleri, modifiye edildi. Viral tayini için alternatif vasıtalar bu yana bu tür bağışıklık, floresans ve transmisyon elektron mikroskopisi, ayarlanabilir darbe dirençli algılama (TRPS) olarak geliştirilmiş ve adapte edilmiş olmakla beraber, sitometrisi yeniden birleşmiş muhbir sistemleri, akış ve kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) bu yöntemler, kopyelemeye yetkin Virionlar 1,3 tanımlama ve miktarını belirlemede başarısız olur. Teknolojiler ve teknikler gelişmeler rafine ve görünümünü değiştirecek devam ederken; plaque deneyleri bulaşıcı litik Virionlar 1,4 viral konsantrasyonlarını belirlemede altın standardı temsil etmeye devam.
Bir plak deneyi esnasında, konakçı hücrelerinin konfluent tek tabaka seri 5-100 virionlann arasında tipik haliyle, bir sayılabilir dizi seyreltildikten bilinmeyen bir konsantrasyonda bir litik virüs ile enfekte edilir. Enfekte tek tabakalar daha sonra gelişigüzel virüs yayılması sırasında, sıvı ortamın mekanik ya da konveksiyon akımı ya da yayılan viral enfeksiyonunu önlemek için bir hareketsizleştirme katlamalı ortamı ile kaplıdır. Örneğin agaroz, metil selüloz ya da karboksimetil selüloz (CMC) gibi katı veya yarı-katı kaplamalar geleneksel olarak kullanılmış olsa da, sıvı kaplamalar, Avicel 5 ila 7 olarak yararlı olan yeni bir sıvı bindirmeleri gelişmesiyle giderek daha çekici bir alternatif haline gelmiştir. Bindirme olabilir gibi geleneksel bindirmeleri karşı sıvı kullanan plaka tahlilleri appl çeşitli avantajları vardırOda sıcaklığında, ve uygulama ve boşaltılması esnasında ied önemli ölçüde daha kolaydır. Sıvı bindirmeleri ısınma gerekmez gibi, hassas ve ısıya dayanıksız virüsler de plak daha kolay ortaya çıkabilir.
Ilk enfeksiyon ve hareketsizleştirici yerleşimi, tek tek plaklar veya hücre ölümü bölgeleri uygulanmasından sonra, viral enfeksiyon ve replikasyon çevreleyen tek tabaka ile sınırlı olan geliştirmeye başlar. Enfekte hücreler, replikasyon parçalama Enfeksiyondan döngüsü devam ayrıca artan bir ayrı ve farklı plaklar ile sonuçlanan, enfeksiyon ilerleyen olacaktır. Kullanılan viral büyüme kinetikleri ve konakçı hücreye bağlı olarak, görünür bir leke, normal olarak 2-14 gün içinde oluşturacaktır. Hücresel monokatmanlar kolayca çıplak gözle plaklar tanımlamak için daha sonra standart bir aydınlık alan mikroskobu ile sayılabilir, ya da daha tipik nötr kırmızı veya şiddet kristal sabit ve zıt olabilir. Mevcut plak karşı lekeleri çok çeşitli, her sunan inci varEIR özgü avantajları ve dezavantajları. Kristal viyole tipik haliyle karışım yapısındaki mevcut olduğu zaman, çok küçük plaklar belirlenmesine izin veren bir hızlı ve farklı karşı leke sağlayan toplama noktasında ve bindirmenin sabitleme / çıkarılmasından sonra ilave edilir. Nötr kırmızı, bilinmeyen bir virüs ya da çoğaltma kinetiği ile çalışırken yararlıdır plak oluşumu, özellikle gelişmekte olan canlı izlenmesi için izin erken uygulanması ve bir kaplama ile sürekli temas avantajına sahiptir. Biz ancak nötr kırmızı ile lekeleme, tipik bir biçimde farklı olmadığını bulduk. Sarı renkli boya lekeler koyu mavi ve viral plaklar kaplamanın kaldırılması gibi olmadan sayılabilir hücrelerin canlı olarak 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazolyum bromürde (MTT), birkaç avantaj sunar nötr kırmızı. MTT ile elde canlı ve ölü hücreleri arasındaki yüksek kontrastlı, daha erken bir zaman noktası, enfeksiyondan sonraki küçük plaklar tespit edilmesine izin verir, Depolama hala bindirme 8 çıkarılmasını gerektirecek olsa da. Kristal mor basit olarak su ve alkol çözeltisi yapılmış ve karışık Plak için yüksek bir hassasiyet derecesi içerir üzere protokol biz de çok sayıda yapı kullanılarak olarak gösterdi sağlamak için, tercih edilen ve basitleştirilmiş karşı leke olarak seçti özelliği virüsleri bulunmaktadır.
Enfekte hücresel mono-katman, sabitleme ve boyama sonrasında, plakalar mililitre başına plak oluşturucu birim (pfu) cinsinden viral stok numuneleri titre etmek için sayılmıştır. 5-100, plaklar bir referans olarak kullanılan bir negatif kontrol grubuna, sayılan arasında bir günlük damla, plaka boyutuna bağlı olarak, seri seyreltileri ile not edilmelidir. İstatistiksel örnekleri örnek karşılaştırarak 3 çoğaltır sayılır, her 100 plaklar için% 10 oranında değişir. Viral titreleri belirlemek için plak tahliller kullanılarak avantajı ağırlık Bulaşıcı viral parçacıkların fiili sayısı miktarını belirlemek için kendi yatmaktadırörnek ithin. Birden çok virionları ve potansiyel olarak tek bir hücre enfekte olabilir zamanda, Virionlar karşı birimleri terminolojisi plak titrasyonu ya da 1,2 sırasında kullanılır.
Plak önemli ölçüde farklı gelişim koşulları altında ve viral türler arasında değişebilir. Onlar söz konusu virüsün büyüme ve virülans faktörleri hakkında değerli bilgiler sağlayabilir olarak plak boyut, berraklık, sınır tanımı ve dağıtım tüm unutulmamalıdır.
Temel plak deneyi ilkelerin aynı zamanda uyarlanmış ve fokus oluşturucu tahlillerde (SYA) olarak kullanılmasında olduğu gibi, farklı şekillerde, bir dizi modifiye edilebilir. SYA'leri plak oluşumunu tespit etmek için hücre erimesi ve counterstaining güveniyor değil, doğrudan doğruya etiketli antikorlar aracılığıyla hücre içi viral proteinleri tespit teknikleri immünboyama istihdam yok. Artan hassasiyet, en önemlisi litik olmayan virüsleri, her farklı olan miktarını belirlemek için yeteneği, enfeksiyondan sonra bir bekleme süresi azalmış veavantajlar SYAleri kullanıldığında. Yaygın olarak kullanılmakla beraber, geleneksel bir plak deneyi kıyasla FFAs olarak kritik sınırlayıcı faktörler, uygun antikorlar için ihtiyaç ve fiili enfeksiyon Virionlar 4 karşısında virüs protein alt-birimleri, yalnızca sondaya yatmaktadır.
Bu çalışmanın amacı sağlamak için, klasik Plak analizi için kısıtlayacağız ve yeni sıvı mikrokristal selüloz bindirmeleri ile birlikte geleneksel katı ve yan katı bindirmeleri (agaroz CMC) kullanımını tarif etmektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Koşulları önemli ölçüde değişebilir gibi başarılı bir plak tahlili için en kritik faktör söz belirli viral kültür için protokol optimizasyon yatıyor. Dikkate almak temel noktalar şunlardır: açıkça plaklar farklılaştırmak için söz konusu virüs, uygun viral büyüme koşulları, yeterli seyreltme aralıkları ile hücresel uyumluluk ev sahipliği, ve söz konusu hücreler ve virüs için doğru bindirme seçimi ve boyama.
VEEV ve RVFV hem aynı konak hücre tiplerinin çok kullanan çok benzer koşullar altında büyürken, plak morfolojisi ve büyüme kinetiği farklılıklar büyük ölçüde değişmektedir. Geleneksel hemorajik ateş virüsleri ve alfavirüsler bir yayılım ve endikatör hücre hattı olarak kullanılmıştır Plak analizi için, Vero hücreleri kullanıldığında, tipik haliyle VEEV RVFV daha yüksek titrelere kadar büyür ve 48 HPI 4 de büyük düzgün plaklar, geliştirme, çoğaltma kinetik artış ortaya koyduğunu, 10-12. VEEV aksine, RVFV 72 HPI gerektirir ve tipik olarak boyut olarak daha küçük ve değişken olan plaklar gösterir.
RVFV karşı ve VEEV olarak, influenza virüsü yüksek konakçı hücre spesifiktir ve doku kültürü yoluyla yaymak için zor olabilir. Grip virüsü için viral giriş ve füzyon normal olarak ev sahibi hücrenin α-sialik asit yüzey reseptörüne bağlanma yoluyla hedef hücreye girişini aracılık viral glikoprotein hamagglutinin (HA) ile hücre yüzey reseptörünün bağlanması ile başlatılır. HA tüm influenza virüsleri membran zarfı içinde mevcut olan ve spesifik bir konakçı hücre proteazı ile alt birimi HA1 ve HA2 bölünme gerektirir trimerik glikoproteinidir. Ayrıca sorunu karmaşık hale getirmektedir, bu bölünme siteleri genellikle viral suşlar 13 arasında değişebilir. Belirli bir doku ile sınırlı olduğunu HA bölebilen proteazların ekspresyonu gibi, ar proteazlarE, genellikle, seçilen konakçı hücrede 13 viral füzyonu ve girişi kolaylaştırmak için, hücre kültür ortamına ilave edildi. Viral HA 14,15 proteolitik aktivasyonu ile (herhangi bir tripsin inaktive serum yokluğunda) çoklu-döngü replikasyonu kolaylaştıran: deneme için TPCK-tripsin MDCK ve Vero hücreleri hem de hücre kültüründe kullanıldığı yaygın olarak kullanılan bir proteazın bir örnektir.
Bu çalışma ve diğerlerinin de gösterildiği gibi, virüs yaşam döngüsünün farklılıklar farklı sınıfları ve virüsleri türler arasında büyük farklılıklar göstermek üzere katlamalı seçimleri, levha biçimleri ve toplama süreleri etkileyebilir. Bizim çalışmamızda, agaroz kaplamaları virüs ve hücre tiplerinin geniş bir yelpazede arasında yararını takviye edici, CMC ya da RVFV ve grip B virüsü, hem sıvı, şablon ya da daha yüksek titrelerde açık plaklar gösterdi. Büyük ölçüde katı fişleri ve basitleştirilmiş lekelenmeye giderilmesinde destekli agaroz düşük bir nihai konsantrasyon kullanma. CMC Genel p gösterdiİnfluenza B virüsü için her üç test virüsler ve üretilen çok küçük ve belirsiz plaklar için bir kaplama olarak oorest etkinlik. Genel CMC, en az arzu edilen özellikleri göstermesine rağmen, hızla büyüyen ve titresi sadece minimal bir azalma ile plak boyutunu azaltmak için görünür olduğu gibi son derece öldürücü virüsler, avantajlı olabilecek kullanımı. Sıvı kaplama bunun kullanım kolaylığı artan hazırlamak son derece basit olduğunu en çok yönlü olduğunu kanıtladı, ve seçilen virüslerin tamamında agarosa karşılaştırılabilir. Daha yüksek geçirimli bir 96 kuyucuklu bir plaka biçiminde, uygulama ve çıkarmaya geleneksel bindirmeleri ile olduğu gibi, katılaşma nedeniyle engellenmiştir, doğru ve tutarlı sonuçlar verilmemiştir. Plakalar daha önce karakterize çoğaltma kinetik olan virüslere bu uyarlamayı sınırlayıcı, toplama noktasına kadar hareket olamaz gibi sıvı bindirmeleri kullanan bir göz opak renk ve plak oluşumunu izlemek için yetersizlik yatıyor.
<pclass = "jove_content"> plak deney koşullarında küçük değişiklikler sonuçlar önemli ölçüde değiştirebilir ve herhangi bir yeni sistem veya teknik değerlendirme ve performans her zaman garanti edilir. Optimize edilmiş ve standardize plak tahlil protokolü her durum için mevcut değil iken daha fazla kullanıcı değişiklikler için yeterli altyapıya sağlarken, bizim rapor, çok yönlülük ve geleneksel kullanım yanı sıra plak deneyleri için yeni sıvı bindirmeleri kolaylığı göstermek.Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank FMC BioPolymer USA for product samples of Avicel. This work was supported through the Defense Threat Reduction Agency grant HDTRA1-13-1-0005 to KK and the NIH research grant 1R15AI100001-01A1to KK.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 6-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 658 160 | |
| 12-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 665 180 | |
| 96-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 655 180 | |
| 96-2ml deep well plate | USA Scientific | C15046314 | For serial dilutions |
| DMEM | Quality Biologicals | 112 013 101 | Cell Media/Diluent |
| 2X EMEM for plaques | Quality Biologicals | 115 073 101 | Warm to 37 oC |
| MEM 100X | Cellgro | 25 025 Cl | |
| Sodium Pyruvate | Cellgro | 25 000 Cl | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140 122 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 081 | |
| HyClone FBS | Thermo Scientific | SH30910.03 | Heat inactivate before use at 62 oC for 30 min |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldritch | A7030-50G | |
| Trypsin TPCK | Sigma Aldritch | T1426-50mg | Make aliquots/Avoid freeze thawing |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| DEAE-Dextran | Sigma Aldritch | D9885-10G | |
| Crystal Violet | Sigma Aldritch | C3886-25G | |
| Formaldehyde Solution | Sigma Aldritch | F8775-500ml | |
| Ethanol denatured Reagent Grade | Sigma Aldritch | 362808-1L | |
| Avicel RC-591 NF | FMC BioPolymer USA | RC-591 NF | Shake vigorously when reconsitiuting for >30 min to homogenize |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-100 | |
| Carboxymethyl cellulose, Sodium Salt Medium Viscosity | Sigma Aldrich | C4888 |
Referências
- Cooper, P. D. The plaque assay of animal viruses. Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).
- Dulbecco, R., Vogt, M. Some problems of animal virology as studied by the plaque technique. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 18, 273-279 (1953).
- Hartley, J. W., Rowe, W. P. Tissue culture cytopathic and plaque assays for mouse hepatitis viruses. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. Soc. Exp. Biol. Med. N. Y. 113, 403-406 (1963).
- Juarez, D., Long, K. C., Aguilar, P., Kochel, T. J., Halsey, E. S. Assessment of plaque assay methods for alphaviruses. J. Virol. Methods. 187, 185-189 (2013).
- Shurtleff, A., Keuhne, A., Biggins, J., Keeney, A. Use of alternative overlays in plaque assays. , (2011).
- Shurtleff, A. C., et al. Standardization of the Filovirus Plaque Assay for Use in Preclinical Studies. Viruses. 4, 3511-3530 (2012).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. -. D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virol. J. 3, 63 (2006).
- Klebe, R. J., Harriss, J. V. A technically simple ‘non-lethal’ vital staining procedure for viral plaque and cell transformation assays. Arch. Virol. 81, 359-362 (1984).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells. Appl. Microbiol. 16, 588-594 (1968).
- Abiko, C., et al. Outbreak of Human Metapneumovirus Detected by Use of the Vero E6 Cell Line in Isolates Collected in Yamagata, Japan, in 2004 and 2005. J. Clin. Microbiol. 45, 1912-1919 (2004).
- Baer, A., et al. Induction of DNA damage signaling upon Rift Valley fever virus infection results in cell cycle arrest and increased viral replication. J. Biol. Chem. 287, 7399-7410 (2012).
- Austin, D., et al. p53 Activation following Rift Valley Fever Virus Infection Contributes to Cell Death and Viral Production. PLoS ONE. 7, (2012).
- Böttcher-Friebertshäuser, E., Stein, D. A., Klenk, H. -. D., Garten, W. Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. J. Virol. 85, 1554-1562 (2011).
- Youil, R., et al. Comparative study of influenza virus replication in Vero and MDCK cell lines. J. Virol. Methods. 120, 23-31 (2004).
- Tobita, K., Sugiura, A., Enomoto, C., Furuyama, M. Plaque assay and primary isolation of influenza a viruses in an established line of canine kidney cells (MDCK) in the presence of trypsin. Med. Microbiol. Immunol. (Berl.). 162, 9-14 (1975).
