JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Imunologia e Infecção

קביעת ריכוז נגיפית באמצעות לוחית מבחני: מערכות כיסוי שימוש מסורתיות וחדשני

Published: November 04, 2014
doi:
10.3791/52065
,
1National Center for Biodefense and Infectious Diseases,George Mason University

Summary

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

Abstract

מבחני פלאק יישארו אחת מהשיטות מדויקות ביותר לכימות הישיר של virons זיהומיות וחומרים אנטי בספירת לוחות בדידים (יחידות זיהומיות ואזורים מתים סלולריים) בתרבית תאים. כאן אנו מדגימים כיצד לבצע assay פלאק בסיסי, וכיצד שכבות וטכניקות שונות מן יכולים להשפיע על היווצרות וייצור שלט. בדרך כלל מצעי כיסוי מוצקים או מוצק למחצה, כגון agarose או תאית carboxymethyl, היו בשימוש כדי להגביל את ההתפשטות נגיפית, מניעת זיהום ללא הבחנה דרך מדיום הגידול הנוזלי. שכבות משותקות להגביל זיהום סלולארי לmonolayer הסמוך, המאפשרות יצירת מוקדי ספיר דיסקרטיים והיווצרות הרובד הבאה. כדי להתגבר על הקשיים כרוכים בשימוש בשכבות מסורתיות, כיסוי נוזל רומן ניצול תאית מייקרו ונתרן תאית carboxymethyl כבר בשימוש יותר ויותר כתחליף בתקןassay פלאק. מבחני פלאק כיסוי נוזליים יכולים להתבצע בקלות בכל 6 או 12 פורמטי צלחת גם סטנדרטיים כמו לכל טכניקות מסורתיות ואין צורך בציוד מיוחד. בשל המצב הנוזלי שלה וקלות הבאים של יישומים וההסרה, פורמטי צלחת microculture יכולים לחלופין להיות מנוצלים כחלופה תפוקה מהירה, מדויקת וגבוהה לtitrations ויראלי קנה מידה גדולה יותר. שימוש בפולימר נוזלי שאינו מחומם צמיג מציע הזדמנות כדי לייעל את העבודה, חוסך בחומרים כימיים, חלל חממה, ועליית בטיחות מבצעית בעת שימוש במעבדות בלימה מסורתיות או גבוהות כמו אין חימום מגיב או כלי זכוכית נדרשת. שכבות נוזל עשויות גם להוכיח רגישות יותר משכבות מסורתיות לאיתור וירוסים יציבים חום מסוים.

Introduction

הבידוד והכימות מדויק של דגימות נגיפיות קיימא היה באופן עקבי מטרת מחקר מתמשכת בוירולוגיה. זה לא היה עד כניסתו של assay פלאק בשנת 1952 כי אמצעי לבחינה איכותי וכמותית לחשב titers ויראלי בעלי החיים פותח 1,2 הראשון. טכניקה זו ראשונה מותאמת ושונה ממבחני הפאג, אשר בעבר שימשו לחישוב titers של פאג'ים המניה בביולוגיה צמח 1,2. בעוד אמצעים חלופיים לכימות נגיפית מאז פיתחו והתאימו, כגון immunoassays, הקרינה ומיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים, חישה מתכונן דופק התנגדות (TRPS), cytometry זרימה, מערכות כתב רקומביננטי, ותגובת השרשרת של פולימראז השעתוק לאחור כמותי (qRT-PCR) , שיטות אלה נכשלים לזהות ולכמת virons המוסמך שכפול 1,3. למרות התקדמות בטכנולוגיות וטכניקות תמשיך לעדן ולשנות את הנוף; plaquמבחני דואר ממשיכים לייצג את תקן הזהב בקביעת ריכוזים נגיפיים לvirons ממס המדבק 1,4.

במהלך assay פלאק, monolayer ומחוברות של תאי מארח נגועה בוירוס ממס של ריכוז ידוע כי כבר בדילול סדרתי לטווח ספיר, בדרך כלל בין 5-100 virions. אז monolayers הנגוע מכוסה בכיסוי בינוני משתק כדי למנוע זיהום ויראלי מההבחנה מתפשט גם הזרימה המכנית או convectional של המדיום הנוזלי במהלך התפשטות נגיפית. בעוד שכבות מוצקות או מוצקה למחצה כגון agarose, תאית מתיל או תאית carboxymethyl (CMC) באופן מסורתי שימשו, שכבות נוזל הפכו חלופה אטרקטיבית יותר ויותר עם ​​ההתפתחות של שכבות נוזל רומן כגון Avicel 5 7. יש מבחני פלאק ניצול נוזלי לעומת שכבות מסורתיות יש מספר יתרונות כמו הכיסוי יכול להיות ApplIED בטמפרטורת חדר, ויישום וההסרה קל יותר באופן משמעותי. כשכבות נוזל אינו דורשות התחממות, וירוסים יציבים עדינים וחום עשויים גם להוכיח קל יותר פלאק.

לאחר ההדבקה והיישום של השכבה המשתקת, לוחות בודדים, או אזורים של מוות של תאים הראשוניים, יתחיל לפתח זיהום ושכפול נגיפיים כמוגבל לmonolayer שמסביב. תאים נגועים ימשיכו את מעגל השכפול תְמוּגָה-הזיהום, הפצת נוספת הזיהום, וכתוצאה מכך לוחות שונים ובדידים יותר ויותר. בהתאם לתא קינטיקה הצמיחה ומארח הנגיפי משמש, שלט נראה לעין יהיה בדרך כלל יוצר בתוך 2-14 ימים. monolayers סלולרי, אז ייספר עם מיקרוסקופ שדה בהיר סטנדרטי, או יותר בדרך כלל קבוע וcounterstained על ידי אדום או קריסטל אלים ניטרליים על מנת לזהות בקלות לוחות בעין בלתי מזוינת. יש מגוון רחב של כתמי דלפק שלט זמין, כל הצעה הEir יתרונות וחסרונות ספציפיים. סגול Crystal מתווסף בדרך כלל בנקודת איסוף ולאחר הקיבוע / הסרת הכיסוי, מתן כתם דלפק מהיר וברור המאפשר לזיהוי לוחיות קטנות מאוד כאשר מעורבת מורפולוגיה היא הווה. יש אדום ניטראלי היתרון של יישום מוקדם וקשר רצוף עם השכבה, המאפשר ניטור החי של פיתוח היווצרות רובד, שהוא שימושי במיוחד בעת עבודה עם קינטיקה וירוס או שכפול לא ידועה. עם זאת מצאנו כי צביעה היא בדרך כלל לא בנבדל בעת שימוש באדום ניטראלי. 3 (4,5-dimethylthiazol-2-י.ל) ברומיד -2,5-diphenyl tetrazolium (MTT) מציע מספר יתרונות, כמו כתמי צבע בצבע הצהובים לחיות תאים ניתן לספור שלטים כחולים ונגיפיים חשוכים ללא ההסרה של השכבה כ עם אדום ניטראלי. ניגודיות הגבוהה בין תאי חיים ומתים המוענקים על ידי MTT גם מאפשרת זיהוי של לוחיות קטנות בפוסט נקודת זיהום מועד מוקדם יותר, אם כי אחסון יהיה עדיין דורש ההסרה של השכבה 8. כסגול גביש יכול להיות פשוט שנעשה בתמיסה של מים ואלכוהול, ומספק רמה גבוהה של רגישות למורפולוגיה פלאק מעורבת, שבחרנו בו ככתם דלפק מועדף ופשוט לפרוטוקול הפגין כפי שאנו תוך שימוש במספר משפחות של רווחה וירוסים מאופיינים.

לאחר תיקון ומכתים את monolayer הסלולרי הנגוע, לוחות נספרים כדי titer דגימות מניית ויראלי במונחים של יחידות פלאק ויוצרים (pfu) למיליליטר. ירידת יומן יצוין בין דילולים סידוריים ו, ​​תלוי בגודל צלחת, בין 5-100 לוחות נספרו, עם ביקורת שלילית המשמשת כנקודת התייחסות. דגימות סטטיסטיים תשתנה ב -10% על כל 100 לוחות נספרו כאשר משווים מדגם משכפל 3. היתרון של שימוש במבחני פלאק כדי לקבוע titers ויראלי טמון ביכולתם לכמת את המספר האמיתי של חלקיקים נגיפיים מדבקים within המדגם. כvirions מרובה עלולה להדביק תא בודד, בטרמינולוגיה של יחידות לעומת virons משמשת במהלך titrations פלאק 1,2.

מורפולוגיה הפלאק יכולה להשתנות באופן דרמטי בתנאי גידול שונים ובין מיני ויראלי. גודל שלט, בהירות, הגדרת גבול, והפצה, שכל לציין שהם יכולים לספק מידע רב ערך על גורמי גדילה וארסיים של הנגיף בשאלה.

יכולים גם להיות מותאמים עקרונות assay פלאק בסיסיים ושונים במספר הדרכים שונות, כגון בשימוש במבחני מיקוד להרכיב (חומצות שומן חופשיות). חומצות שומן חופשיות לא להסתמך על תמוגה תא וcounterstaining לזהות היווצרות הפלאק, אלא להעסיק immunostaining טכניקות כדי לזהות ישירות חלבונים נגיפיים תאיים באמצעות נוגדנים מתויגים. רגישות מוגברת, ירידה בזמני דגירה לאחר הדבקה, והכי חשוב היכולת לכמת וירוסים לא אלימים כל מובחניםיתרונות כאשר העסקת חומצות שומן חופשיות. בעוד בשימוש נרחב, הגורמים המגבילים הקריטיים בחומצות שומן חופשיות לעומת assay פלאק מסורתי טמון בצורך בנוגדנים מתאימים ויכולת הבדיקה רק עבור יחידות משנה חלבון נגיפיות לעומת virons זיהומיות בפועל 4.

לצורך מחקר זה, אנו מגבילים את הדיון שלנו למבחני פלאק קלאסיים ומתארים את השימוש בשכבות מסורתיות מוצקות ומוצקות למחצה (CMC agarose ו), יחד עם שכבות תאית מייקרו נוזל רומן.

Protocol

1. הכנת תאים וריאגנטים היום לפני assay, תאי הצלחת המתאימים מארח לווירוס בשאלה (טבלה 1 ו -2) ב90-100% confluency. הכן את פתרון תיקון של פורמלדהיד 10% ב DH 2 O. בדוגמא, לערבב 5.56 מיליליטר של 36% פורמלדהיד מניות עם 14.44 מיליליטר מזוקק H 2 O (DH 2 O). הערה: שיטות טיפול בטוחות מתאים שימוש ואוורור בעת שימוש בפורמלדהיד. הכן כתם סגול גביש: 1% קריסטל ויולט (CV) ב -20% אתנול ו DH 2 א ' הכן תקשורת שלט 2x (סוג תא תלוי בריכוז 2x; ראה טבלה 2). לסנן באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר אם כל חומרים כימיים לא סטרילי. הכנת שכבות משתקות (לוח 3) לשכבות נוזל, להפוך את פתרון 2.4% סטרילי של Avicel ב DH 2 O. כדי למנוע יצירת גושים, מוסיף את האבקה לבקבוק המכיל מים ה, במהירות ערבוב עם בר ומערבב שופכים Avicel באיטיות ומערבבים במהירות בטמפרטורת חדר (RT). כאשר הפתרון מוכיח צמיג מדי עבור בר ומערבב להומוגני, לעבור לייקר בקבוק ל> 30 דקות עם תסיסה כבדה כדי להבטיח גם הומוגניזציה. הערה: פתרונות מניות יכולים להתבצע בריכוזים נמוכים, אך הפתרונות יכולים להפריד ויהיה צורך רמיקס כדי להבטיח תפעול. פתרונות עבודה של Avicel ניתן להשתמש החל 0.6-3%. לאחר הומוגניזציה, חיטוי הפתרון והחנות האטום ב RT. לagarose ושכבות תאית carboxymethyl (CMC), להכין פתרון המניה ב DH 2 O של 2% CMC או agarose 0.6%. מערבבים עם בר ומערבב וחיטוי או במיקרוגל כדי להביא לפתרון. 2. דילולים וזיהומים היום לאחר ציפוי, לבדוק חזותי את confluency ויכולת קיום של התאים לפני תחילת assay. ודא מורפולוגיה תאית סטנדרטיתnd monolayer ומחוברות ~ 90% היא הווה. לבצע דילול סדרתי פי עשר מהדגימות זיהומיות. השתמש בתקשורת הצמיחה הסלולרית להתפשטות נגיפית כמדלל (טבלה 2). להשתנות מספר דילולים הנדרשים המבוסס על כייל הצפוי של הנגיף בשאלה, ותמיד להשתמש במדגם שליטה נגוע כדי להבטיח יכולת קיום סלולרית וסיוע בזיהוי לוחית באופן עצמאי. מהדילולים הסידוריים, להדביק את התאים למשך 45 דקות לשעה 1 (טבלה 1). השתמש בנפח מספיק של הבידוד כדי לכסות את התאים, תוך שמירה על הנפח נמוך ככל האפשר על מנת למקסם את הקשר נגיפי עם monolayer (לוח 4). צלחות בעדינות רוק כל 20 דקות כדי להבטיח גם כיסוי ולמנוע monolayer הסלולרי מייבוש. לאחר ההדבקה, כיסוי נפח מתאים של משתק בינוני ישירות לinoculums בבאר (הטבלה 2) באמצעות 1: לערבב 1 של מדיה שלט 2x וimmobilizing כיסוי של בחירה (CMC, agarose או Avicel). נער בעדינות כדי לערבב. לשכבות נוזל, לערבב 1: 1 עם תקשורת חיממה 2x רובד ו1.2-2.4% מניות RT Avicel להשיג פתרון עבודה של .6-1.2% בינוניים כיסוי Avicel. לשכבה agarose, להשתמש 1: תערובת 1 של מדיה שלט 2x חימם ופתרון מניות של agarose 0.6% מחוממים, מקום באמבט מים C ° 56 למשך 30 דקות כדי לאזן את טמפרטורת קבלת ריכוז agarose / כיסוי סופי של 0.3 %. לCMC, להכין פתרון מניית 2% ולטפל כפי שתואר עבור שכבת agarose. כאשר מיישם את השכבה לmonolayer, תמיד לאזן חם agarose או CMC במים C ° 56 כדי למנוע נזק לשכבה. להבטיח את הפתרון הוא חם, אבל לא חם למגע כדי למנוע מוות של תאים וtiters ויראלי מופחת. רוב שכבות agarose תתחיל לגבש מתחת 42 מעלות צלזיוס, לעבוד במהירות ו / או להכין קבוצות קטנות כדי למנוע התמצקות בזמן הטיפול. לאחר תוספת של השכבה, דגירה צלחות לייצר לוחות שונים שהם בבירור ספיר. היווצרות הפלאק יכולה לקחת 2-14 ימים, תלוי בווירוס להיות מנותחים, טבלת 1. הערה: לאחר צלחות מעולפות נוזל ממוקמות בחממה, לא להעביר אותם. תנועה של שכבות הנוזל במהלך תקופת הדגירה תגרום ללוחות נמרחו. שכבות Agarose וCMC הן מוצקה למחצה וניתן להעביר או נבדקות מעת לעת תחת מיקרוסקופ אור לעקוב אחר התפתחות רובד. 3. תיקון ותאי מכתים כדי לתקן התאים, לשפוך את או לשאוב את שכבת Avicel, ולתקן את התאים באמצעות תמיסת פורמלדהיד 10% למשך 30 דקות ללילה (<1 מ"ל לכל טוב לצלחת גם 6). לagarose או CMC, להוסיף ישירות תמיסת פורמלדהיד לכיסוי עבור שעה 1 ללילה. הערה: אפשר לשמור דוגמאות לפרקי זמן ארוכים במקבעות בתנאי שהוא עושהלא תתאדה ויתייבש כמו זה יכול לעוות את השכבה. לפני מכתים ולאחר קיבוע, להשליך את הפורמלין, ולהסיר את האטמים המוצק למחצה עבור agarose וCMC גם עם מים זורמים או באופן ידני עם מרית. יש לשטוף את לוחות Avicel עם מים כדי להסיר את כיסוי / מקבע שייר לפני מכתים. עבור מכתים, לכסות את התאים עם כמות מינימאלית של פתרון סגול גביש ל~ 15 דקות. צלחות רוק במידת צורך, כדי להבטיח כיסוי אפילו. לשטוף בעדינות את הכתם סגול קריסטל עם מים. ברגע קבוע, מוכתם, ומיובש, לוחות חנות ללא הגבלת זמן לניתוח בעתיד. 4. קביעת titers ויראלי לספור את השלטים בכל טוב, לוקח את הממוצע לכל משכפל טכני של אותו הדילול. לפורמטי צלחת גדולים, בארות הנחה עם פחות מ 5 או יותר מ -100 לוחות. שימו לב לגודל שלט ומורפולוגיה. הביקורת השלילית צריכה monolayer אחיד ויכול לשמש כשליטת התייחסות. לקבוע את כייל הנגיף של מניית המדגם על ידי לקיחת המספר הממוצע של לוחות לדילול והפוך בסך הכל גורם לדילול. הערה: כדוגמא, 30 ו -32 לוחות נספרו למשכפל של 1 x 10 -7 הדילול [31 (ממוצע) / 10 -7 (דילול) x 0.4 מיליליטר (הבידוד)] יניב כייל של 7.75 x 10 8 pfu / מיליליטר.

Representative Results

היכולת של מבחני פלאק להעריך נכונה titers ויראלי מסתמכת על מספר רב של גורמים: בחירת תא המארח מתאימה, תקשורת נכונה ותנאי גידול לכדאיות סלולרית ונגיפית, התפשטות נגיפית משותקת, וקביעה מדויקת של תקופת הדגירה הנגיפית כדי לאפשר זמן מספיק לצורך ברור והיווצרות רובד ספיר. במחקר זה, וירוסים משלוש משפחות מייצגות נבחרו כדי להדגים הבדלים ב: בחירת כיסוי, תקופת דגירה, ומורפולוגיה פלאק על פני שונה סוגי מדגם. ונצואלה סוסי דלקת קרום המוח (VEEV) נבחרה כמודל ויראלי (+) ssRNA, אשר יכול לגרום למחלה משמעותית במינים ובני אדם סוסים ומייצג את משפחת Togaviridae. מתח טייוואן השפעת B, מפולח (-) וירוס ssRNA בעיקר מדביק בני אדם, מייצג את משפחת Orthomyxoviridae. בקעת וירוס קדחת (RVFV), – וירוס של פרוקים-רגלי ssRNA נולד בעיקר הדבקת פרוקי רגליים, ()מעלי גירה ובני אדם, נבחר כנציג משפחת Bunyaviridae. לRVFV (איור 1), כייל נקבעו מפתרון מניות של זן רקומביננטי חי מוחלש MP12 של RVFV בפורמט 12 צלחת גם ניצול CMC, agarose, או שכבות Avicel שהודגרו צד-לצד לזיהום שלאחר 72 שעות (HPI). צלחת נציג מראה דילולים הנעים בין 10 4- עד 10 -7 ניתן לראות בלוחות א לוח באמצעות CMC ושכבות agarose הראו שלטים קטנים, ברורים, וברורים עם גבול מעגלי מוגדר היטב. לוחות עם כיסוי נוזל היו מעט יותר עשירים וגדולים יותר בהשוואה לagarose ושלטי CMC, וסיפקו גבול פחות ברור. titers ויראלי הושווה בלוח ב 'עם כל שכבות ביצוע comparably. על מנת לקבל השוואה ויזואלית ברורה בין שכבות לMP12 יחד עם גודל מדגם גדול יותר כדי לקבוע רפרודוקציהibility, צלחת 6 היטב גם trialed בשלושה עותקים (איור 2). בפורמט צלחת 6 היטב, השימוש בכיסוי CMC הראה לוחות קטנים יותר או שכבות agarose או נוזל, שהיו דומים בהגודל לזה. וכייל נגיפיים היו דומים בין כל שלוש שכבות (לוח ד '), לוחות שנוצרו בשכבות agarose ונוזל הוכיחו קלים יותר לספור בשל הגודל המוגבר שלהם. בניגוד לRVFV, כייל VEEV ומורפולוגיה רובד בין שכבות השונות מגוונות במידה ניכרת (איור 3 א). לוחות נוצרו בשכבות CMC הפגינו מורפולוגיה ברורה ומובחנת בעת שימוש בתבנית צלחת גם 12, על חשבון גודל שלט ורגישות (לוח ב '). בניגוד לCMC, השימוש בשכבות agarose והנוזל הביאו לוחות גדולים יותר באופן משמעותי, המצביע נמוך עיכוב נגיפי ורגישות מוגברת לשכפול VEEV. זו אושרה בעבר אך ורק כאשר משווה agarose לעומת CMC בapaper פורסם על ידי חוארז et al. 4. בעוד agarose ונוזלי שכבות מיוצרות לוחות גדולים יותר מCMC, הלוחות שמוגדרים היטב גבולות והיו קשים לספור בפורמט גם 12, עם שכבות נוזל המספקות דיפוזיה הגבול הגדולה ביותר. כאשר לוחות היו trialed ב 6 צלחות היטב (איור 4), הפורמט גם 6 הגדול שלל את הנושא של לוחות גדולים בגלוי שהיו קשה להבדיל בפורמט גם 12, עם agarose ושכבות נוזל המוכיחים עדיף על שכבות CMC במונחים של הגדרת שלט וברגישות (4D איור). בהשוואה לRVFV או VEEV, שפעת מספקת מספר אתגרים ייחודיים בעת plaquing, כגון החובה של פרוטאז חיצוני. הרגישות של נגיף שפעת לבחירות של כיסוי שונה גם תועדה היטב בעבר כשינויים משמעותיים כבר ציינו כאשר שינויים קלים כמו שונה מותגים של agarose יש להיותen משמש 9. מעניין עבור זן השפעת B טייוואן, השימוש בCMC כשכבת הביא לוחות ניכר קטנים יותר שהיו קשים לספור והיו קשה להבקיע אמין (איור 5 א). השימוש בשכבת agarose סיפק את הלוחות הטובים ביותר (לוח ג), וגרם לכתם כהה ברקע (כנראה עקב כדאיות monolayer מוגברת), והראה שלטים ברורים וחדים יותר בהשוואה ישירה לשימוש בשכבת הנוזל (לוח ב ' ). יתרון בולט של פולימרים נוזליים על שכבות מוצקות ומוצקות למחצה, כגון agarose וCMC, טמון בקלות של ההסרה ויישום. שכבות חצי קשות דורשות חימום, ומיצוק יכול להתגלות כבעייתי בעת טיפול והסרת. על מנת לנצל את היתרונות הללו ולקבוע את המעשיות של ניצול Avicel באופן תפוקה גבוהה לRVFV, פורמט צלחת 96 גם היה trialed בconcentrati כיסוי שונהתוספות (איור 6). לRVFV MP-12, דילולים בוצעו ארבע פעמים בשני 0.6 ו -1.2% הריכוזים הסופיים של Avicel. יישום והסרת כיסוי הוכיחו פשוטים, ללא הבדלים נראות לעין בין משכפל או בין הריכוזים ציינו, מפגינים רמה גבוהה של שחזור. כאשר הבקיע, לוחות היו ברורים וספיר לעין בלתי מזוינת, הוכחת ההיתכנות של ניצול שכבות נוזל באופן תפוקה גבוה לRVFV. איור 1:. השוואות כיסוי פלאק RVFV ניצול 12 צלחות גם Veros היו מצופות על 2.5 x 10 5 תאים ב -12 צלחות גם ונגוע ב200 μl באמצעות אותה בדילול סדרתי המדגם התחלתי של MP12. לאחר ההדבקה 1.5 שכבות מיליליטר של agarose 0.3%, 0.6% Avicel, או 1% CMC (ג הסופיoncentrations), יושמו על מנת להשוות באופן ישיר את שכבות כפי שהודגם בלוח א הפלאק נספרו וtitered בלוח ב '. איור 2:. השוואות כיסוי פלאק RVFV ניצול 6 צלחות גם Veros היו מצופות ב 5 x 10 5 תאים ב 6 צלחות גם ונגוע ב400 μl באמצעות אותה בדילול סדרתי המדגם התחלתי של MP12. שלוש שכבות מיליליטר של agarose 0.3%, 0.6% Avicel, או 1% CMC, יושמו על מנת להשוות באופן ישיר את שכבות כפי שהודגמו בלוח, ניסויים נפרדים B, ו- C. בוצעו באופן זהה כפי שתואר עבור הפנלים AC, עם לוחות נספרו וtitered בלוח D (N = 3). איור 3: <השוואות strong> שלט VEEV כיסוי ניצול 12 צלחות גם. Veros היו מצופות על 2.5 x 10 5 תאים ב -12 צלחות גם ונגועה ב200 μl באמצעות אותה בדילול סדרתי המדגם התחלתי של זן תרכיב VEEV TC-83. לאחר הדבקת 1.5 שכבות מיליליטר של agarose 0.3%, 0.6% Avicel, או 1% CMC, יושמו על מנת להשוות באופן ישיר את שכבות כפי שהודגמו בלוח א הפלאק נספרו וtitered בלוח ב ' איור 4:. השוואות כיסוי פלאק EEV V ניצול 6 צלחות גם Veros היו מצופות ב 5 x 10 5 תאים ב 6 צלחות גם ונגועה ב400 μl באמצעות אותה בדילול סדרתי המדגם התחלתי של VEEV TC-83. לאחר הדבקה, 3 מיליליטר שכבות של agarose 0.3%, 0.6% Avicel, או 1% CMC, יושמו על מנת להשוות באופן ישיר את שכבות כפי שהודגמהבפנלים, ניסויים נפרדים 'ו- ג בוצעו באופן זהה כפי שתוארו עבור פנלים – C, עם לוחות נספרו וtitered בלוח D (N = 3). איור 5: השוואת כיסוי פלאק שפעת תאי MDCK היו מצופים ב 5 x 10 5 תאים ב 6 צלחות גם ונגוע ב400 μl של הבידוד תוך שימוש באותו דילול סדרתי המדגם התחלתי של שפעת B טייוואן.. אין בסרום שור העובר (FBS) שימש בתקשורת הצמיחה או שכבות, כמו FBS יכול לעכב התפשטות שפעת באמצעות עיכוב של פרוטאזות מסוימת הנדרשים להיתוך ויראלי. TPCK-טריפסין התווסף לכל שכבות לפני יישום על מנת לאפשר איחוי ויראלי וכניסה עם תאי המארח. לאחר הדבקה, 3 מיליליטר שכבות של agarose 0.3%, 0.6% Avicel, או 1% CMC יושמו על מנת להשוות באופן ישירשכבות כפי שהודגם בלוח, B וניסויים נפרדים ג בוצעו באופן זהה כפי שתוארו בפנלים – C, עם לוחות נספרו וtitered בלוח D (N = 3). בעוד ממוצע נלקח ללוחות CMC הם היו קשים לספור באופן אמין כפי שהם הפגינו גבולות מפוזרים וגדלי שלט קטנים מאוד. איור 6:. שכבות שלט תפוקה גבוהה צלחת גם 96 של Veros מצופה ב 3 x 10 4 תאים לכל טוב, היו נגועות ב-50 μl של הבידוד תוך שימוש באותו דילול סדרתי מדגם התחלתי של RVFV MP12 עבור שעה 1, ארבע פעמים. לשכבות, 0.6 ו -1.2% ריכוזים סופיים של Avicel היו trialed כדי לקבוע את הכדאיות ואת שחזור של ניצול שכבות נוזל באופן תפוקה גבוהה, פנלי A ו- B. RVFV VEEV שפעת B סוג התא Vero Vero MDCK תקופת הדבקה 1 שעה 1 שעה 45 דקות זמן דגירה 3 ימים 2 ימים 3 ימים סוגי רובד תנאי הרכבת Assay וניידים: טבלה 1 RVFV VEEV שפעת B סוג התא Vero Vero MDCK סוג גידול DMEM 1 DMEM 1 DMEM 2 שלט מדיה 2xEMEM 2xEMEM 2xEMEM B הנשר בינוני השתנה של 1. Dulbecco בתוספת 10% בסרום שור עוברי, 1% L-גלוטמין, 1% Penicllin / סטרפטומיצין. הנשר בינוני השתנה של 2. Dulbecco בתוספת 1% L-גלוטמין, 1% Penicllin / סטרפטומיצין, 0.2% בסרום אלבומין שור, 0.025% HEPES, 50ug / מיליליטר DEAE-Dextran. מדיה א 2x המינימלית חיונית (500 מיליליטר) בתוספת 5% FBS (25 מיליליטר), חומצות אמינו (5 מיליליטר) Essential 1% מינימום, 1% נתרן פירובט (5 מיליליטר), 1% L-גלוטמין (5 מיליליטר), 2% פן / סטרפטוקוקוס (10 מיליליטר). מדיה ב 2x המינימלי חיונית (500 מיליליטר) בתוספת 0.2% הסרום אלבומין שור, חומצות אמינו חיוניות 1% מזערי (5 מיליליטר), 50ug / מיליליטר, 0.025% HEPES, DEAE-Dextran, טריפסין-TPCK * * רק לפני ההכנה, להוסיף 1 μl לכל 25מיליליטר של 2 מיקרוגרם / מיליליטר מניות של TPCK-טריפסין לaliquot תשתמש לערבב עם agarose ללוחות. טבלה 2: רובד וויראלי / סלולארי הצמיחה Medias RVFV VEEV שפעת B סוג התא Vero Vero MDCK תקופת הדבקה 1 שעה 1 שעה 45 דקות זמן דגירה 3 ימים 2 ימים 3 ימים פתרונות כיסוי לא יפקעו כאשר עשו כל כך הרבה זמן כעקרות נשמר. טבלה 3: מאגר בשכבות 6 גם גם 12 96 גם # של תאים / היטב 5 x 10 5 2.5 x 10 5 3 x 10 4 נפח של innoculum (μl) 400 200 50 נפח של שכבה (מיליליטר) 3 1.5 0.100 לוח 4: פורמטי פלייט

Discussion

השיקול החשוב ביותר עבור assay פלאק מוצלח טמון באופטימיזציה של הפרוטוקול לתרבות הנגיפית המסוימת בשאלת תנאים יכולים להשתנות באופן משמעותי. נקודות מפתח לקחת בחשבון הן: לארח תאימות סלולרית עם הווירוס בשאלה, תנאי גידול נגיפיים מתאימים, טווחי דילול מספיק כדי לבדל את הפלאק באופן ברור, ובחירה נכונה כיסוי וצביעה לתאים ווירוס בשאלה.

בעוד VEEV וRVFV לגדול בתנאים דומים מאוד ניצול רב של סוגים אותו התא מארח, הבדלים בקינטיקה מורפולוגיה וצמיחת השלט להשתנות באופן משמעותי. בעת השימוש בתאי Vero למבחני פלאק, אשר באופן מסורתי שימשו כקו תא התפשטות ומחוון לאיתור וירוסי קדחת מדממת וalphaviruses, VEEV בדרך כלל גדל למכייל גבוה מRVFV ומדגים מוגבר קינטיקה שכפול, פיתוח לוחות אחידים גדולים ב 48 HPI 4, 10-12. בניגוד לVEEV, RVFV דורש 72 HPI ומדגים לוחות שהם בדרך כלל הרבה יותר קטנים ומשתנים בגודל.

בניגוד לRVFV וVEEV, וירוס השפעת הוא מאוד תא מארח ספציפי ויכול להיות קשה כדי להפיץ באמצעות תרבית רקמה. לנגיף השפעת, כניסה והיתוך ויראלי בדרך כלל ביוזמת המחייב של קולט פני תא עם hamagglutinin הנגיפי גליקופרוטאין (HA), שמתווך בכניסה לתא המטרה באמצעות קשירה עם קולט משטח חומצת α-sialic של התא המארח. HA הוא גליקופרוטאין trimeric שנמצא במעטפת הקרום של כל נגיפי השפעת ודורש מחשוף לHA1 יחידות משנה וHA2 על ידי הפרוטאז תא מארח ספציפי. כדי לסבך את הנושא עוד יותר, אתרי מחשוף אלה יכולים לעתים קרובות להשתנות בין זני נגיפים 13. כביטוי של פרוטאזות מסוגלת ביקוע HA מוגבל לרקמות ספציפיות, פרוטאזות arדואר לעתים קרובות הוסיף לתרבית תאי תקשורת על מנת להקל היתוך וכניסה נגיפיים אל תוך תא המארח נבחר 13. TPCK-טריפסין הוא דוגמא אחת לפרוטאז נפוץ המשמש בתרבות תא עם שני תאי Vero MDCK ו: להקל שכפול רב-מחזור (בהעדר סרום inactivating טריפסין) באמצעות הפעלת מפרקי החלבונים של HA ויראלי 14,15.

כפי שהודגם במחקר זה ואחרים, הבדלים במחזורי חיים של נגיף יכולים להשפיע על בחירות כיסוי, פורמטי צלחת, ופעמים אוסף, עם סטיות משמעותיות בין מעמדות ומינים של וירוסים שונים. במחקר שלנו, שכבות agarose הפגינו שלטים ברורים יותר בטיטר גבוה יותר מאשר כל אחד CMC או שכבות נוזל לשני RVFV ושפעת B וירוס, חיזוק השירות שלה בקרב מגוון רחב של וירוסים וסוגי תאים. שימוש בריכוז סופי נמוך של agarose סייע רב בהסרת פקקים מוצקים וצביעה פשוטה. CMC כולל הפגין pיעילות oorest כשכבת עבור כל שלושת הווירוסים נבדקו ושלטים קטנים מאוד ולא ברורים הופקו לשפעת B וירוס. למרות CMC הכולל הפגין מאפיינים הפחות רצויים, השימוש בו במהירות גוברת ומאוד וירוסים ארסיים יכולים להוכיח יתרון, כפי שעשה מופיע כדי להקטין את גודל שלט עם ירידה מזערית בלבד בכייל. הכיסוי הנוזלי הוכיח להיות המגוון ביותר בכך שהיא הייתה מאוד פשוטה להכנה, גדל קל שימוש, והיה דומה לagarose על פני כל הווירוסים שנבחרו. בפורמט 96-גם צלחת התפוקה גבוהה יותר, יישום וההסרה לא מעוכב בשל התמצקות כעם שכבות מסורתיות, וסיפק תוצאות מדויקות ועקביות. בחשבון בעת ​​שימוש בשכבות נוזל טמון בצביעה וחוסר היכולת לעקוב אחר היווצרות רובד האטומה שלא ניתן להעביר את הצלחות עד נקודת האיסוף, הגבלת העיבוד הזה לוירוסים עם קינטיקה השכפול אפיין בעבר את.

<pclass = "jove_content"> שינויים קלים בתנאי assay פלאק יכול לשנות באופן משמעותי את תוצאות, והערכת ביצועים של כל מערכת או שיטה חדשה תמיד היא מוצדקות. בעוד פרוטוקול assay פלאק מותאם ואחיד אינו קיים עבור כל מצב, הדוח שלנו להפגין את הרבגוניות וקלות שימוש במסורתי, כמו גם שכבות נוזל חדשניות למבחני פלאק, תוך מתן רקע מספיק לשינויים נוספים של משתמש.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank FMC BioPolymer USA for product samples of Avicel. This work was supported through the Defense Threat Reduction Agency grant HDTRA1-13-1-0005 to KK and the NIH research grant 1R15AI100001-01A1to KK.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
6-well CellStar plate for tissue culture Greiner Bio-One 658 160
12-well CellStar plate for tissue culture Greiner Bio-One 665 180
96-well CellStar plate for tissue culture Greiner Bio-One 655 180
96-2ml deep well plate USA Scientific C15046314 For serial dilutions
DMEM Quality Biologicals 112 013 101 Cell Media/Diluent
2X EMEM for plaques Quality Biologicals 115 073 101 Warm to 37 oC
MEM 100X  Cellgro 25 025 Cl
Sodium Pyruvate  Cellgro 25 000 Cl
Penicillin Streptomycin Gibco 15140 122
L-Glutamine Gibco 25030 081
HyClone FBS  Thermo Scientific SH30910.03 Heat inactivate before use at 62 oC for 30 min
Bovine Serum Albumin Sigma Aldritch A7030-50G
Trypsin TPCK Sigma Aldritch T1426-50mg Make aliquots/Avoid freeze thawing
HEPES  Gibco 15630-080
DEAE-Dextran Sigma Aldritch D9885-10G
Crystal Violet Sigma Aldritch C3886-25G
Formaldehyde Solution Sigma Aldritch F8775-500ml
Ethanol denatured Reagent Grade Sigma Aldritch 362808-1L
Avicel RC-591 NF FMC BioPolymer USA RC-591 NF Shake vigorously when reconsitiuting  for >30 min to homogenize
UltraPure Agarose  Invitrogen 16500-100
Carboxymethyl cellulose, Sodium Salt Medium Viscosity  Sigma Aldrich C4888
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Cooper, P. D. The plaque assay of animal viruses. Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).
  2. Dulbecco, R., Vogt, M. Some problems of animal virology as studied by the plaque technique. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 18, 273-279 (1953).
  3. Hartley, J. W., Rowe, W. P. Tissue culture cytopathic and plaque assays for mouse hepatitis viruses. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. Soc. Exp. Biol. Med. N. Y. 113, 403-406 (1963).
  4. Juarez, D., Long, K. C., Aguilar, P., Kochel, T. J., Halsey, E. S. Assessment of plaque assay methods for alphaviruses. J. Virol. Methods. 187, 185-189 (2013).
  5. Shurtleff, A., Keuhne, A., Biggins, J., Keeney, A. Use of alternative overlays in plaque assays. , (2011).
  6. Shurtleff, A. C., et al. Standardization of the Filovirus Plaque Assay for Use in Preclinical Studies. Viruses. 4, 3511-3530 (2012).
  7. Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. -. D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virol. J. 3, 63 (2006).
  8. Klebe, R. J., Harriss, J. V. A technically simple ‘non-lethal’ vital staining procedure for viral plaque and cell transformation assays. Arch. Virol. 81, 359-362 (1984).
  9. Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells. Appl. Microbiol. 16, 588-594 (1968).
  10. Abiko, C., et al. Outbreak of Human Metapneumovirus Detected by Use of the Vero E6 Cell Line in Isolates Collected in Yamagata, Japan, in 2004 and 2005. J. Clin. Microbiol. 45, 1912-1919 (2004).
  11. Baer, A., et al. Induction of DNA damage signaling upon Rift Valley fever virus infection results in cell cycle arrest and increased viral replication. J. Biol. Chem. 287, 7399-7410 (2012).
  12. Austin, D., et al. p53 Activation following Rift Valley Fever Virus Infection Contributes to Cell Death and Viral Production. PLoS ONE. 7, (2012).
  13. Böttcher-Friebertshäuser, E., Stein, D. A., Klenk, H. -. D., Garten, W. Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. J. Virol. 85, 1554-1562 (2011).
  14. Youil, R., et al. Comparative study of influenza virus replication in Vero and MDCK cell lines. J. Virol. Methods. 120, 23-31 (2004).
  15. Tobita, K., Sugiura, A., Enomoto, C., Furuyama, M. Plaque assay and primary isolation of influenza a viruses in an established line of canine kidney cells (MDCK) in the presence of trypsin. Med. Microbiol. Immunol. (Berl.). 162, 9-14 (1975).

Tags

Viral ConcentrationPlaque AssayOverlay SystemsAgaroseCarboxymethyl CelluloseLiquid OverlayMicrocrystalline CelluloseViral TitrationHigh ThroughputHeat Labile Viruses

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems. J. Vis. Exp. (93), e52065, doi:10.3791/52065 (2014).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image