Virale Concentratie Bepaling Door Plaque Testen: met behulp van traditionele en Novel Overlay System
Summary
Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.
Abstract
Plaque assays blijven één van de meest accurate methode voor directe kwantificering van infectieuze vironen en antivirale stoffen door het tellen van afzonderlijke plaques (infectieuze eenheden en cellulaire dode zones) in celcultuur. Hier laten we zien hoe een eenvoudige plaque assay uitgevoerd en hoe uiteenlopende overlays en technieken kunnen beïnvloeden plaquevorming en productie. Typisch vaste of halfvaste overlay substraten, zoals agarose of carboxymethylcellulose zijn gebruikt om virale verspreiding te beperken, voorkomen willekeurige besmetting door het vloeibare groeimedium. Geïmmobiliseerd overlays beperken cellulaire infectie aan de direct omliggende monolaag, waardoor de vorming van discrete telbare brandpunten en de daaropvolgende vorming van tandplak. Om de problemen die inherent zijn aan traditionele overlays overwinnen, heeft een nieuw vloeibaar overlay gebruikmaking microkristallijne cellulose en carboxymethylcellulose natrium steeds meer gebruikt als een vervanger in de normplaque assay. Liquid overlay plaque assays kan gemakkelijk worden uitgevoerd in een van beide standaard 6 of 12 wells plaat formaten per traditionele technieken en vereisen geen speciale apparatuur. Door zijn vloeibare toestand en vervolgens gemakkelijk aanbrengen en verwijderen, kan microkweek plaatformaten ook worden gebruikt als een snelle, accurate en high throughput alternatief voor grootschalige virale titraties. Het gebruik van een niet-verwarmde viskeuze vloeistof polymeer biedt de mogelijkheid om werk te stroomlijnen, conserveert reagentia, incubator ruimte, en verhoogt de operationele veiligheid bij gebruik in traditionele of high containment labs als geen reagensverwarmingssysteem of glaswerk zijn vereist. Liquid overlays kan ook blijken gevoeliger dan traditionele overlays voor bepaalde hitte labiel virussen.
Introduction
De accurate isolatie en kwantificering van levensvatbare virale monsters heeft consequent geweest van een lopend onderzoek doel in virologie. Het was niet tot de komst van de plaque-test in 1952, dat een middel om kwantitatief en kwalitatief te berekenen dierlijke virale titers werd voor het eerst ontwikkeld 1,2. Deze techniek werd voor het eerst aangepast en gewijzigd uit faag assays, die eerder was gebruikt om titers voorraad bacteriofagen berekenen in plant biology 1,2. Terwijl alternatieve middelen voor virale kwantificering zijn inmiddels ontwikkeld en aangepast, zoals immunoassays, fluorescentie en transmissie elektronenmicroscopie, afstembare resistieve puls sensing (TRPS), flowcytometrie, recombinant reportersystemen en kwantitatieve reverse transcriptie polymerase kettingreactie (qRT-PCR) , deze methoden niet replicatiecompetente vironen 1,3 identificeren en te kwantificeren. Terwijl de vooruitgang in technologieën en technieken verder te verfijnen en het landschap te veranderen; plaque assays steeds de gouden standaard vertegenwoordigen bepalen virale lytische concentraties infectieuze vironen 1,4.
Tijdens een plaque assay is een confluente monolaag van gastheercellen geïnfecteerd met een lytisch virus van een onbekende concentratie die werd serieel verdund tot een telbare bereik, typisch tussen 5-100 virions. Geïnfecteerde monolagen worden vervolgens bedekt met een overlay immobiliserende medium te voorkomen virale infectie willekeurig verspreid door zowel de mechanische of convectional stroming van het vloeibare medium bij virale propagatie. Hoewel vaste of halfvaste Bekleding zoals agarose, methylcellulose en carboxymethylcellulose (CMC) van oudsher gebruikt, zijn vloeibare bekledingen steeds aantrekkelijk alternatief met de ontwikkeling van nieuwe vloeibare bekledingen worden bijvoorbeeld Avicel 5- 7. Plaque assays met behulp van vloeibare versus traditionele overlays hebben een aantal voordelen zoals de overlay kan applied bij kamertemperatuur en toepassing en verwijdering aanzienlijk eenvoudiger. Als vloeibare overlays geen opwarming vereist, kan delicate en warmte labiel virussen ook blijken makkelijker te plaque.
Na de eerste infectie en toepassing van het immobiliserende overlay individuele plaques of zones van celdood, zal beginnen te ontwikkelen virale infectie en replicatie beperkt zijn tot de omringende monolaag. Geïnfecteerde cellen de replicatie-lysis-infectiecyclus voortgezet verder verspreiding van de infectie, resulterend in steeds verschillende en discrete plaques. Afhankelijk van de virale groeikinetiek en gastheercel wordt een zichtbare plaque vormen normaal binnen 2-14 dagen. Cellulaire monolagen kan dan worden geteld met een standaard helderveld microscoop of typischer gefixeerd en tegengekleurd met neutraal rood of kristal gewelddadige om gemakkelijk plaques identificeren met het blote oog. Er is een grote verscheidenheid van plaque tegen vlekken voorzien, elk met their specifieke voor- en nadelen. Kristalviolet wordt kenmerkend toegevoegd op het verzamelpunt en na de fixatie / verwijdering van de bekleding, die een snelle en duidelijke teller vlek die zorgt voor de identificatie van kleine plaques wanneer gemengd morfologie aanwezig is. Neutraal rood heeft het voordeel van vroegtijdige toepassing en voortdurend contact met de overlay, waardoor de levende bewaking ontwikkelen plaquevorming, wat vooral nuttig bij het werken met een onbekend virus of replicatie kinetiek. Wij hebben echter ontdekt dat vlekken is meestal niet als onderscheiden bij het gebruik van neutraal rood. 3- (4,5-dimethyl-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT) biedt verschillende voordelen, zoals de gele kleurstof vlekken levende cellen donkerblauw en virale plaques te tellen zonder verwijdering van de overlay met neutraal rood. Het hoge contrast tussen levende en dode cellen wordt geboden door MTT maakt ook de detectie van kleine plaques op een eerder tijdstip na infectieHoewel opslag nog verwijdering van de overlay 8 vereist. Als kristal violet eenvoudig worden gemaakt in een oplossing van water en alcohol, en zorgt voor een hoge mate van gevoeligheid voor gemengd plaque morfologie, hebben we gekozen als geprefereerde en vereenvoudigde teller kleuring voor het protocol aangetoond dat we gebruik meerdere families goed gekarakteriseerde virussen.
Na de vaststelling van en het kleuren van de geïnfecteerde cel monolaag, worden plaques geteld om virale voorraadmonsters titreren in termen van plaque-vormende eenheden (pve) per milliliter. Een log druppel opgemerkt tussen seriële verdunningen en afhankelijk plaatformaat tussen 5-100 plaques geteld, met een negatieve controle gebruikt als referentie. Statistisch monsters zullen variëren met 10% voor elke 100 plaques geteld bij het vergelijken van sample repliceert 3. Het voordeel van plaque assays voor virale titers vast ligt in hun vermogen om het werkelijke aantal infectieuze virusdeeltjes kwantificeren wedurende het monster. Als meerdere virusdeeltjes zou kunnen infecteren van een enkele cel, wordt de terminologie van eenheden versus vironen gebruikt tijdens plaque titraties 1,2.
Plaque morfologie kan variëren sterk onder verschillende groeiomstandigheden en tussen virale soorten. Plaque grootte, helderheid, grens definitie en distributie moet worden opgemerkt zij waardevolle gegevens over de groei en virulentie factoren van het virus in kwestie verschaffen.
Basic plaque assay principes kunnen worden aangepast en gemodificeerd op een aantal verschillende manieren, zoals het gebruik focus vormende assays (FFA). FFAs vertrouw niet op cellysis en tegenkleuring om plaquevorming te detecteren, maar eerder in dienst immunokleuren technieken om intracellulaire virale eiwitten direct te detecteren door middel van tag antilichamen. Verhoogde gevoeligheid, verlaagd incubatietijden na infectie, en vooral de mogelijkheid kwantificeerbaar niet-lytische virussen allemaal verschillendvoordelen bij toepassing FFA. Alom gebruikte, de kritische beperkende factoren in FFA versus een traditionele plaque assay ligt in de noodzaak van passende antilichamen en het vermogen om enige probe virale eiwit subeenheden en werkelijke infectieuze vironen 4.
Voor het doel van deze studie, zullen we onze discussie beperken tot de klassieke plaque assays en beschrijven het gebruik van traditionele solide en halfvaste overlays (agarose en CMC), samen met nieuwe vloeistof microkristallijne cellulose overlays.
Protocol
Representative Results
Discussion
De belangrijkste factor voor een succesvolle plaque assay ligt in het optimaliseren van het protocol voor de betreffende virale cultuur vraag omstandigheden sterk kunnen verschillen. Belangrijke punten rekening zijn: gastheer cellulaire verenigbaarheid met het virus betrokken geschikte virale groei omstandigheden voldoende verdunningsgebieden om duidelijk onderscheid plaques en correct overlay selectie en kleuring van de cellen en virus in kwestie.
Terwijl VEEV en RVFV beide groeien onder zeer vergelijkbare omstandigheden gebruikmaking veel van dezelfde gastheercel soorten verschillen in morfologie plaque en groeikinetiek variëren aanzienlijk. Bij het gebruik van Vero-cellen voor plaque assays, die traditioneel worden gebruikt als een vermeerdering en indicator cellijn voor hemorragische koorts virussen en alfavirussen, VEEV groeit meestal tot hogere titers dan RVFV en demonstreert verhoogde replicatie kinetiek, het ontwikkelen van grote uniforme plaques op 48 hpi 4, 10-12. In tegenstelling tot VEEV, RVFV vereist 72 HPI en toont plaques die kenmerkend veel kleiner en variabele grootte.
Tegenover RVFV en VEEV, het influenzavirus zeer specifieke gastheercel en kan moeilijk te verspreiden via weefselkweek. Voor het influenza virus, is virale binnenkomst en fusie gewoonlijk geïnitieerd door de binding van het celoppervlak receptor met het virale glycoproteïne hamagglutinin (HA), welke men de doelcel via binding medieert de gastheercel α-siaalzuur oppervlak receptor. HA is een trimeer glycoproteïne die in de membraanenvelop alle Influenza virussen en vereist splitsing in de subeenheden HA1 en HA2 door een specifieke gastheercel protease. Om de kwestie verder te compliceren, kan deze klievingsplaatsen vaak variëren tussen virusstammen 13. Aangezien de expressie van proteasen kunnen splitsen HA is beperkt tot specifieke weefsels, proteasen are vaak toegevoegd aan celkweek media om virale fusie en de toegang tot de geselecteerde gastheercel 13 te vergemakkelijken. TPCK-trypsine is een voorbeeld van een algemeen gebruikte protease die wordt gebruikt in celkweek met zowel MDCK en Vero-cellen: multicyclische replicatie (in de afwezigheid van trypsine te inactiveren serum) vergemakkelijkt door de proteolytische activatie van virale HA 14,15.
Zoals aangetoond in deze studie en anderen, kunnen verschillen in virale levenscycli overlay selecties, plaat formaten en collectie tijden, met aanzienlijke verschillen invloed onder verschillende klassen en soorten van virussen. In onze studie, agarose overlay aangetoond duidelijker plaques hogere titers dan zowel CMC of vloeibaar overlays voor zowel RVFV en Influenza B virus, versterkt het nut onder diverse virussen en celtypen. Met behulp van een lage uiteindelijke concentratie van agarose enorm geholpen bij het verwijderen van de vaste stekkers en vereenvoudigde vlekken. CMC algemeen toonde de poorest werkzaamheid als een overlay voor alle drie virussen getest en geproduceerd zeer klein en onduidelijk plaques voor Influenza B-virus. Hoewel de totale CMC toonde de minst gewenste eigenschappen, het gebruik ervan in snel groeiende en zeer virulente virussen kan voordelig blijken, zoals zij lijken plaque verkleinen met slechts een minimale afname in titer. De vloeistof overlay bleek de meest veelzijdige doordat zijn het zeer eenvoudig te bereiden, toegenomen gebruiksgemak, en was vergelijkbaar met agarose in alle geselecteerde virussen. In een hogere doorvoer 96-well plaat formaat, toepassing en verwijdering niet geremd door stollen als traditionele overlays en ontvangen accurate en consistente resultaten. Een overweging bij het gebruik van vloeibare overlays ligt in de ondoorzichtige kleur en onvermogen om plaquevorming te monitoren als de platen niet kan worden verplaatst, totdat de punt van verzameling, het beperken van deze aanpassing aan virussen met eerder gekarakteriseerd replicatie kinetiek.
<pclass = "jove_content"> Kleine aanpassingen in plaque assay omstandigheden kunnen de resultaten aanzienlijk te veranderen, en de evaluatie en de uitvoering van een nieuw systeem of techniek altijd nodig is. Terwijl een geoptimaliseerde en gestandaardiseerde plaquetest protocol bestaat niet voor iedere situatie, ons rapport tonen de veelzijdigheid en gebruiksgemak in zowel traditionele als nieuwe vloeibare overlays voor plaque assays, terwijl het verstrekken van een voldoende achtergrond voor verdere gebruiker wijzigingen.Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank FMC BioPolymer USA for product samples of Avicel. This work was supported through the Defense Threat Reduction Agency grant HDTRA1-13-1-0005 to KK and the NIH research grant 1R15AI100001-01A1to KK.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 6-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 658 160 | |
| 12-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 665 180 | |
| 96-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 655 180 | |
| 96-2ml deep well plate | USA Scientific | C15046314 | For serial dilutions |
| DMEM | Quality Biologicals | 112 013 101 | Cell Media/Diluent |
| 2X EMEM for plaques | Quality Biologicals | 115 073 101 | Warm to 37 oC |
| MEM 100X | Cellgro | 25 025 Cl | |
| Sodium Pyruvate | Cellgro | 25 000 Cl | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140 122 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 081 | |
| HyClone FBS | Thermo Scientific | SH30910.03 | Heat inactivate before use at 62 oC for 30 min |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldritch | A7030-50G | |
| Trypsin TPCK | Sigma Aldritch | T1426-50mg | Make aliquots/Avoid freeze thawing |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| DEAE-Dextran | Sigma Aldritch | D9885-10G | |
| Crystal Violet | Sigma Aldritch | C3886-25G | |
| Formaldehyde Solution | Sigma Aldritch | F8775-500ml | |
| Ethanol denatured Reagent Grade | Sigma Aldritch | 362808-1L | |
| Avicel RC-591 NF | FMC BioPolymer USA | RC-591 NF | Shake vigorously when reconsitiuting for >30 min to homogenize |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-100 | |
| Carboxymethyl cellulose, Sodium Salt Medium Viscosity | Sigma Aldrich | C4888 |
Referências
- Cooper, P. D. The plaque assay of animal viruses. Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).
- Dulbecco, R., Vogt, M. Some problems of animal virology as studied by the plaque technique. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 18, 273-279 (1953).
- Hartley, J. W., Rowe, W. P. Tissue culture cytopathic and plaque assays for mouse hepatitis viruses. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. Soc. Exp. Biol. Med. N. Y. 113, 403-406 (1963).
- Juarez, D., Long, K. C., Aguilar, P., Kochel, T. J., Halsey, E. S. Assessment of plaque assay methods for alphaviruses. J. Virol. Methods. 187, 185-189 (2013).
- Shurtleff, A., Keuhne, A., Biggins, J., Keeney, A. Use of alternative overlays in plaque assays. , (2011).
- Shurtleff, A. C., et al. Standardization of the Filovirus Plaque Assay for Use in Preclinical Studies. Viruses. 4, 3511-3530 (2012).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. -. D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virol. J. 3, 63 (2006).
- Klebe, R. J., Harriss, J. V. A technically simple ‘non-lethal’ vital staining procedure for viral plaque and cell transformation assays. Arch. Virol. 81, 359-362 (1984).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells. Appl. Microbiol. 16, 588-594 (1968).
- Abiko, C., et al. Outbreak of Human Metapneumovirus Detected by Use of the Vero E6 Cell Line in Isolates Collected in Yamagata, Japan, in 2004 and 2005. J. Clin. Microbiol. 45, 1912-1919 (2004).
- Baer, A., et al. Induction of DNA damage signaling upon Rift Valley fever virus infection results in cell cycle arrest and increased viral replication. J. Biol. Chem. 287, 7399-7410 (2012).
- Austin, D., et al. p53 Activation following Rift Valley Fever Virus Infection Contributes to Cell Death and Viral Production. PLoS ONE. 7, (2012).
- Böttcher-Friebertshäuser, E., Stein, D. A., Klenk, H. -. D., Garten, W. Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. J. Virol. 85, 1554-1562 (2011).
- Youil, R., et al. Comparative study of influenza virus replication in Vero and MDCK cell lines. J. Virol. Methods. 120, 23-31 (2004).
- Tobita, K., Sugiura, A., Enomoto, C., Furuyama, M. Plaque assay and primary isolation of influenza a viruses in an established line of canine kidney cells (MDCK) in the presence of trypsin. Med. Microbiol. Immunol. (Berl.). 162, 9-14 (1975).
