Floresan Nanopartiküller Uygulama Hücre içi Bakteri tarafından Endo-lizozomal Sistemi Modelleme Eğitim için
Summary
Bu makalede, sentezi ve nanopartiküllerin floresan etiketleme (UP) için yöntemler tarif etmektedir. NPler ökaryotik hücrelerin endo-lızozomal sistemi etiket darbe kovalayıcı deneyler uygulanmıştır. Hücre içi patojen Salmonella enterica faaliyetleri ile Endo-lizozomal sistemin Manipülasyon canlı hücre görüntüleme ve sayısal izledi.
Abstract
Arzu kimyasal, optik ve mekanik özelliklere sahip Floresan nanopartiküller (NPS) hücre içi organellere etiketlemek için umut verici araçlardır. Burada, biz ökaryotik hücrelerin Endo-lizozomal sistem etiket ve hücre içi patojen Salmonella enterica konak hücresel yolların manipülasyonları izlemek için altın BSA-rodamin NPs kullanarak bir yöntemi tanıtmak. NPS kolayca geç endozomlar / lizozomlarında HeLa hücreleri tarafından içselleştirilmiş ve lokalize edildi. Salmonella enfeksiyonu Salmonella kaynaklı zar yapılarında vezikül ve NP birikimi yeniden düzenlenmesini bağlı. Biz konfokal mikroskopi görüntüleri kantitatif analizleri için Imaris yazılım paketi dağıtmış. nesne sayısı ve enfekte olmayan hücreler içinde boyut dağılımı çok WT Salmonella endo-lızozomal sistemin yeniden modelleme gösteren Salmonella ile enfekte olan hücrelerde olanlardan çok farklıdırlar.
Introduction
Vb metal NPlerin, kuantum noktalar, polimer NPlerin, silika NP, karbon noktalar da dahil olmak üzere Floresan nanopartiküller (NPS), geçmiş yıllarda 1,2 sırasında büyük ilgi çekmiştir. Geleneksel organik boyalara kıyasla, floresan NPler gibi güçlü sinyal gücü, direnç photobleaching ve yüksek biyouyumluluk 3,4 olarak arzu kimyasal, optik ve mekanik özellikleri göstermektedir. Bu avantajlar, onları hücre içi algılama ve canlı hücre görüntüleme için tercih edilen yöntem yapmak. Ayrıca, elektron-yoğun NP çeşitli EM 5 ile ultrastrüktürel düzeyde ışık mikroskobu (LM) ve daha yüksek çözünürlükte izleme canlı hücrenin kombinasyonu tanır ilişkili mikroskopik analiz, onların kullanımını kolaylaştıran, elektron mikroskobu (EM) ile görebilir. Örneğin, altın NPler verimli bir şekilde hassas teşhisi için canlı hücreler hem de bağışıklık etiketleme 6 alanında biyosensörler olarak kullanılan uzun zaman olmuştur. Son studies farklı boyut ve şekle sahip, altın NPler hücre kuşaklarının büyük bir çeşitliliği tarafından alımı ve rutin olarak endozomal yolu ile taşıma, dolayısıyla büyük bir potansiyele olmak hücre içi vezikül taşıma takip ve endo-lızozomal sistem etiketleme uygulanmış kolaylıkla olabilir göstermektedir 7,8 .
Salmonella enterica, Shigella flexneri ve Listeria monocytogenes gibi Mikrobiyal patojenler, fagositik olmayan konak hücreleri 9 istila farklı mekanizmalar geliştirmişlerdir. Içselleştirilmiş sonra, patojenler, ya sitoplazmada lokalize veya zar-bağlı bölümlerinde tecrit, ev sahibi ortamları ile yoğun etkileşim ve kendi yaşam 10 lehine bu modüle. Örneğin, Salmonella enterica bulunduğu ve bir hücre içi phagosomal bölmesi enfeksiyonu 11 üzerine Salmonella ihtiva-eden çarpıtma (SCV) olarak adlandırılan içinde çoğaltır. olgunlaşan SCV, Golgi aygıtının doğru trafikleri endositik yolunun sürekli etkileşimleri geçiren ve Salmonella -kaynaklı filamentler olarak geniş tübüler yapılar, (SIF), neksin tübülleri sıralama, Salmonella indüklenen salgı taşıyıcı membran proteini 3 (SCAMP3) tübüller, vb oluşumunu uyarır . 12-14. Bu bakteriyel patojenler, konukçu hücre yolları değiştirme konusunda incelenmesi anlama bulaşıcı hastalık için gereklidir.
Burada, altın BSA-rodamin NPler konak hücresel endo-lizozomal sistemi etiketlemek için sıvı izleyiciler olarak kullanıldı, ve insan gastrointestinal patojen Salmonella enterica serovar Typhimurium (Salmonella) ile patojen etkileşimlerini incelemek için bir model bakteri olarak kullanıldı endositik yolu ev sahipliği. WT Salmonella ya da mutant suşları ile enfekte enfekte olmayan hücreler ve hücre içi altın BSA rodamin NPler konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) ile görüntülendi.Daha sonra Imaris yazılım Salmonella enfeksiyonu endozomlar / lizozomların aşırı yeniden düzenlenmesine neden olduğunu gösteren, NP dağılımını ölçmek için kullanıldı. Bu yöntemin açıklaması ardından, benzer deneyler içselleştirilmiş NP uzun vadeli kaderini izlemek ve ökaryotik hücrelerin endositik yolu üzerinde çeşitli eksojen maddelerin veya endojen faktörlerin etkisini araştırmak için dizayn edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
memeli hücrelerinin bir endo-lızozomal sistemi besin alımı, hormon-kaynaklı sinyal iletimi, immün gözetim ve antijen sunumu 17 de dahil olmak üzere önemli fizyolojik işlemleri kontrol eder. Şimdi, belirteçlerin çeşitli endositik yolu ve izleme çalışmaları etiketlenmesi için kullanılmıştır kadar. Örneğin, Lysotracker probları seçici düşük iç pH hücre bölmesi içinde birikir ve etkin bir şekilde, nanomolar konsantrasyonlarda 18 de canlı hücreleri etiketlemek olabil…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft by grant Z within Sonderforschungsbereich 944 ‘Physiology and Dynamics of Cellular Microcompartments’ and HE1964/18 within priority program 1580.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| Gold chloride | Sigma-Aldrich | 520918 | |
| Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
| tri-sodium citrate | Sigma | C8532 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| NHS-Rhodamine | Pierce | 46406 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Gentamicin | Applichem | A1492 | |
| Kanamcyin | Roth | T832 | |
| Carbenicillin | Roth | 6344 | |
| 8-well chamber slides | Ibidi | 80826 | tissue culture treated, sterile |
| Imaris Software | Bitplane | version 7.6 | various configurations available |
Referências
- Coto-Garcia, A. M. Nanoparticles as fluorescent labels for optical imaging and sensing in genomics and proteomics. Anal. Bioanal. Chem. 399, 29-42 (2011).
- Xie, J., Lee, S., Chen, X. Nanoparticle-based theranostic agents. Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 1064-1079 (2010).
- Ruedas-Rama, M. J., Walters, J. D., Orte, A., Hall, E. A. Fluorescent nanoparticles for intracellular sensing: a review. Anal. Chim. Acta. 751, 1-23 (2012).
- Wu, C., Chiu, D. T. Highly fluorescent semiconducting polymer dots for biology and medicine. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 3086-3109 (2013).
- Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots. Nat. Methods. 2, 743-749 (2005).
- Kumar, D., Saini, N., Jain, N., Sareen, R., Pandit, V. Gold nanoparticles: an era in bionanotechnology. Expert Opin. Drug Deliv. 10, 397-409 (2013).
- Dykman, L. A., Khlebtsov, N. G. Uptake of engineered gold nanoparticles into mammalian cells. Chem. Rev. 114, 1258-1288 (2014).
- Chithrani, B. D., Ghazani, A. A., Chan, W. C. Determining the size and shape dependence of gold nanoparticle uptake into mammalian cells. Nano Lett. 6, 662-668 (2006).
- Finlay, B. B., Cossart, P. Exploitation of mammalian host cell functions by bacterial pathogens. Science. 276, 718-725 (1997).
- Bhavsar, A. P., Guttman, J. A., Finlay, B. B. Manipulation of host-cell pathways by bacterial pathogens. Nature. 449, 827-834 (2007).
- Malik-Kale, P., et al. Salmonella – at home in the host cell. Front. Microbiol. 2, 125 (2011).
- Rajashekar, R., Liebl, D., Seitz, A., Hensel, M. Dynamic remodeling of the endosomal system during formation of Salmonella-induced filaments by intracellular Salmonella enterica. Traffic. 9, 2100-2116 (2008).
- Schroeder, N., Mota, L. J., Meresse, S. Salmonella-induced tubular networks. Trends Microbiol. 19, 268-277 (2011).
- Drecktrah, D., Knodler, L. A., Howe, D., Steele-Mortimer, O. Salmonella trafficking is defined by continuous dynamic interactions with the endolysosomal system. Traffic. 8, 212-225 (2007).
- Slot, J. W., Geuze, H. J. A new method of preparing gold probes for multiple-labeling cytochemistry. Eur. J. Cell Biol. 38, 87-93 (1985).
- Zhang, Y., Hensel, M. Evaluation of nanoparticles as endocytic tracers in cellular microbiology. Nanoscale. 5, 9296-9309 (2013).
- Pollard, T. D., Earnshaw, W. C., Lippincott-Schwartz, J. Chapter 22. Cell Biology. , (2007).
- . . LysoTracker and LysoSensor Probes. , (2013).
- Shi, H., He, X., Yuan, Y., Wang, K., Liu, D. Nanoparticle-based biocompatible and long-life marker for lysosome labeling and tracking. Anal. Chem. 82, 2213-2220 (2010).
- Hensel, M. Genes encoding putative effector proteins of the type III secretion system of Salmonella pathogenicity island 2 are required for bacterial virulence and proliferation in macrophages. Mol. Microbiol. 30, 163-174 (1998).
- Beuzon, C. R., et al. Salmonella maintains the integrity of its intracellular vacuole through the action of SifA. EMBO J. 19, 3235-3249 (2000).
