Aislamiento y Caracterización cuantitativa inmunocitoquímica de células miogénicas Primarias y fibroblastos de músculo esquelético humano

La reparación y la regeneración del músculo esquelético requiere la acción de las células satélite ^1, las células madre miogénicas ^2,3. In vivo estas células existen en un estado quiescente reversible situado entre el sarcolema y la lámina basal de cada miofibrillas, pero se activan para proliferar, fusibles y diferenciarse como el tejido muscular están dañados, reparar y regenerar ^3. Las células satélite se pueden aislar a partir de muestras de biopsia de músculo humano joven y de edad avanzada utilizando digestión enzimática ⁴ y sus propiedades miogénicos posteriormente se pueden estudiar en la cultura primaria ^5. La eficiencia de este proceso de aislamiento con respecto a tanto el rendimiento y la pureza de la población de células depende de los métodos utilizados y puede variar de muestra a muestra. Los dos principales tipos de células adherentes obtenidas a partir de la digestión enzimática son las células satélite (células miogénicas ahora denominados o células precursoras de músculo), identificados inicialmente como células CD56 ⁺ / desmina, y mufibroblastos SCLE derivados, identificadas como CD56 ^– y TE7 ^{+ 5} células. Los fibroblastos tienen una tasa de proliferación rápida y no se someten a la detención del crecimiento y la diferenciación terminal irreversible al contacto célula-célula, como las células miogénicas; por lo tanto en poblaciones mixtas, los fibroblastos pueden invadir células miogénicas a dominar la cultura.

Los fibroblastos a menudo se han visto como una irritación para los biólogos musculares, sin embargo, ahora existe un creciente interés en los fibroblastos como células dignos de estudio por derecho propio, en particular, ya que han demostrado tener un papel cooperativo con células miogénicas durante la reparación del músculo ⁶ . El aislamiento y purificación de diferentes tipos de células de músculo humano es por lo tanto una consideración metodológica importante cuando se trata de investigar el comportamiento innato de ambos tipos de células en cultivo. Activada por fluorescencia de células (FACS) es un método por el cual las células pueden ser ordenados para el estudio adicional y / o se contaron y seanalizada. FACS se ha demostrado para enriquecer de forma fiable células miogénicas humanos, pero el rendimiento de las células para el cultivo posterior hasta el momento no ha sido alto ^7. Dado el potencial de replicación limitado de células somáticas, tales como células derivadas de células satélite miogénicas y muy pobre la proliferación y diferenciación asociados con la senescencia ^4, se requieren métodos más suaves. Culturas individuales de fibras musculares ofrecen otra, menos agresivo, los medios de obtención de células satélite murinos todavía residente en su nicho sublaminal y después de su activación en la cultura ^8,9. Sin embargo, esto a menudo no es posible a partir del material de biopsia de músculo humano (porque las fibras rara vez se pueden obtener de tendón a tendón) lo que significa que esta técnica puede no ser accesible a muchos laboratorios de investigación interesados ​​en el estudio de células derivadas de músculo humanos. Por otra parte, la técnica de la fibra individual sólo proporciona el número de células muy limitadas.

Aquí se describe un sistema de clasificación basada en el gendigestión enzimática TLE de células utilizando colagenasa y dispasa seguido por dos rondas sucesivas de clasificación magnética de células activadas (MACS), que da a la vez una alta pureza (> 95% de células miogénicas) y rendimiento (~ 2,8 x 10 ⁶ ± 8,87 x 10 ⁵ células / g de tejido) para experimentos en la cultura. CD56 se considera el marcador de superficie estándar de oro para la identificación de las células satélite humanos in situ e in vitro ^{10 11} y proporciona el candidato ideal marcador de superficie para la fijación del talón. En este enfoque anticuerpos CD56 conjugados con óxido de hierro y perlas superparamagnéticas que contiene polisacárido se une a las células y pasa a través de una columna de separación celular magnética de alto gradiente colocado en un fuerte campo magnético ^12,13. Las columnas de separación se llenan con una matriz de lana de acero o de hierro esferas ferromagnéticas que sirven para enfocar líneas de campo magnético hacia su superficie generar fuertes gradientes de campo magnético (~ 4tesla) ¹⁴. En estas columnas incluso células ligeramente magnéticos son atraídos y absorbidos a su superficie ^14. Sin consolidar (CD56 ^-) las células pasan a través de la columna mientras que las células CD56 ⁺ etiquetados con microperlas magnéticas se conservan hasta la retirada del campo magnético ^12,15.

Las suspensiones celulares de cualquier etapa del proceso de clasificación se pueden colocaron en placas a la densidad deseada para la experimentación adicional. A raíz de una intervención dada los constituyentes celulares pueden identificarse utilizando inmunocitoquímica, utilizando imágenes de campo amplio o microscopía de fluorescencia confocal y analizados cuantitativamente usando un enfoque de análisis de imágenes que permite una rápida medición objetiva de todas las células marcadas en cualquier imagen dada. En nuestro laboratorio hemos utilizado este enfoque doble clasificación inmunomagnética seguido por análisis de imagen ¹⁶ para demostrar que CD56 ^– fibroblastos humanos transdifferentiate fácilmente en los adipocitos, mientras que las células myogenics de origen satélite son altamente resistentes a esta conversión adipogenic ^5.