Isolamento e quantitativa immunocitochimica caratterizzazione di cellule miogeniche primarie e fibroblasti da muscolo scheletrico umano

La riparazione e la rigenerazione del muscolo scheletrico richiede l'azione delle cellule satelliti ^1, le cellule staminali miogeniche ^2,3. In vivo esistono queste cellule in uno stato di quiescenza reversibilmente situato tra il sarcolemma e la lamina basale di ogni myofibre, ma si attivano a proliferare, fusibile e differenziare in tessuto muscolare è danneggiato, riparati e rigenerati ^3. Le cellule satelliti possono essere isolate da biopsie muscolari umane giovani e anziani con la digestione enzimatica ⁴ e le loro proprietà miogenici può essere successivamente studiato in colture primarie ^5. L'efficienza di questo processo di isolamento per quanto riguarda sia la resa e la purezza della popolazione cellulare dipende dai metodi utilizzati e può variare da campione a campione. I due principali tipi di cellule aderenti ottenuti dalla digestione enzimatica sono le cellule satelliti (cellule miogeniche ora chiamati o cellule precursori del muscolo), identificato inizialmente come cellule CD56 ⁺ / desmina e mufibroblasti SCLE-derivati, identificati come CD56 ^– e TE7 ^{+ 5} celle. I fibroblasti hanno un tasso di proliferazione rapida e non subiscono irreversibile arresto della crescita e differenziazione terminale al contatto cellula-cellula come le cellule miogeniche; quindi in popolazioni miste, fibroblasti possono overrun cellule miogeniche a dominare la cultura.

I fibroblasti sono stati spesso visti come un fastidio per i biologi muscolari, tuttavia, vi è ora un crescente interesse in fibroblasti da cellule degni di studio e propri, in particolare per quanto essi hanno dimostrato di avere un ruolo di collaborazione con cellule miogeniche durante la riparazione del muscolo ⁶ . L'isolamento e purificazione di diversi tipi di cellule di muscolo umano è quindi un importante considerazione metodologica quando si cerca di studiare il comportamento innata di entrambi i tipi di cellule in coltura. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) è un metodo con cui le cellule possono essere ordinati per ulteriori studi e / o contati eanalizzati. FACS è stato dimostrato per arricchire affidabile cellule miogeniche umane, ma la resa di cellule per la coltura successiva non è stata finora alta ^7. Dato il potenziale di replica limitato di cellule somatiche come le cellule satellite cellule derivate miogenici e più poveri proliferazione e differenziamento associati senescenza ^4, sono necessari approcci più dolci. Culture fibre muscolari singole offrono un altro, meno aggressivo, mezzi per ottenere cellule satelliti murine ancora residente nella loro nicchia sublaminal e dopo la loro attivazione in cultura ^8,9. Tuttavia, questo non è spesso possibile dal materiale bioptico muscolo umano (perché fibre possono raramente essere ottenuti da tendine tendine) significa che questa tecnica non può essere accessibile a molti laboratori di ricerca interessati a studiare cellule derivate muscolari umane. Inoltre, la tecnica singola fibra fornisce solo il numero di cellule molto limitato.

Qui si descrive un sistema di ordinamento basato sulla genTLE digestione enzimatica delle cellule usando collagenasi e dispasi seguita da due successivi cicli di cellule attivate magnetica smistamento (MACS) che fornisce sia una purezza elevata (> 95% di cellule miogeniche) e la resa (~ 2,8 x 10 ⁶ ± 8,87 x 10 ⁵ cellule / g di tessuto) per esperimenti in coltura. CD56 è considerato il marcatore di superficie gold standard per l'identificazione delle cellule satelliti umane in situ ¹⁰ e in vitro ¹¹ e fornisce la superficie ideale marcatore candidato per il fissaggio tallone. In questo approccio anticorpi CD56 coniugati ad ossido di ferro e-polisaccaride contenente microsfere superparamagnetiche sono vincolati alle cellule e passato attraverso un alto gradiente colonna di separazione cellulare magnetica posto in un forte campo magnetico ^12,13. Le colonne di separazione sono riempiti con una matrice di lana di acciaio o ferro sfere ferromagnetiche che servono a concentrare le linee del campo magnetico verso la superficie generano forti gradienti di campo magnetico (~ 4tesla) ¹⁴. In queste colonne cellule leggermente magnetici anche sono attratti e assorbiti alla loro superficie ^14. Unbound (CD56 ^-), le cellule passano attraverso la colonna, mentre CD56 ⁺ cellule marcate con microsfere magnetiche vengono mantenuti fino rimozione dal campo magnetico ^12,15.

Le sospensioni cellulari da qualsiasi fase del processo di sequenziazione possono essere placcati alla densità desiderata per ulteriori sperimentazioni. A seguito di un determinato intervento dei costituenti cellulari possono essere identificati mediante immunocitochimica, ripreso con grande campo o la microscopia confocale e analizzati quantitativamente usando un approccio di analisi delle immagini che permette una rapida misurazione oggettiva di tutte le cellule marcate in ogni immagine data. Nel nostro laboratorio abbiamo usato questo doppio approccio ordinamento immunomagnetica seguita da analisi di immagine ¹⁶ per dimostrare che CD56 ^– fibroblasti umani prontamente transdifferenziarsi in adipociti, mentre cellulare miogenicos di origine satellite sono altamente resistenti a questa conversione adipogenico ^5.