मानव कंकाल की मांसपेशी से प्राथमिक myogenic कोशिकाओं और fibroblasts के अलगाव और मात्रात्मक Immunocytochemical विशेषता
Summary
The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.
Abstract
मरम्मत और कंकाल की मांसपेशी के उत्थान निवासी मांसपेशी स्टेम कोशिकाएं हैं जो उपग्रह कोशिकाओं की कार्रवाई की आवश्यकता है। ये संस्कृति में अध्ययन मानव पेशी बायोप्सी enzymatic पाचन का उपयोग कर नमूने और उनके myogenic गुणों से अलग किया जा सकता है। मात्रात्मक, enzymatic पाचन से प्राप्त दो मुख्य पक्षपाती सेल प्रकार के होते हैं: (i) के उपग्रह CD56 + के रूप में शुरू की पहचान की कोशिकाओं (करार दिया myogenic कोशिकाओं या मांसपेशी अग्रदूत कोशिकाओं), और बाद में CD56 / + desmin + कोशिकाओं और (ii) muscle- और ते-7 + – CD56 के रूप में पहचान ली गई fibroblasts,। Fibroblasts संस्कृति में बहुत कुशलता से पैदा करना और मिश्रित सेल आबादी में इन कोशिकाओं संस्कृति हावी करने के लिए myogenic कोशिकाओं उग सकता है। मानव पेशी से विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के अलगाव और शुद्धि इस प्रकार संस्कृति में या तो सेल प्रकार की सहज व्यवहार की जांच के लिए कोशिश कर रहा है जब एक महत्वपूर्ण पद्धति विचार है। यहाँ हम descrदोनों एक उच्च शुद्धता (> 95% myogenic कोशिकाओं) और अच्छी उपज (~ देता है जो कोलैजिनेज का उपयोग कोशिकाओं की कोमल enzymatic पाचन के आधार पर छंटाई और चुंबकीय सक्रिय सेल छँटाई (एमएसीएस) द्वारा पीछा dispase की एक प्रणाली IBE 2.8 एक्स 10 6 ± 8.87 संस्कृति में प्रयोगों के लिए इन विट्रो में 7 दिन) के बाद x 10 5 कोशिकाओं / जी ऊतक। यह दृष्टिकोण CD56 के खिलाफ एक एंटीबॉडी संयुग्मित चुंबकीय microbeads के मोतियों के साथ मिश्रित पेशी व्युत्पन्न सेल की आबादी incubating और फिर एक चुंबकीय क्षेत्र में हालांकि कोशिकाओं गुजर पर आधारित है। Microbeads के लिए बाध्य CD56 + कोशिकाओं CD56 जबकि क्षेत्र द्वारा बनाए रखा जाता है – कोशिकाओं कॉलम के माध्यम से बेरोक गुजरती हैं। छँटाई प्रक्रिया के किसी भी स्तर से सेल निलंबन चढ़ाया और सुसंस्कृत किया जा सकता है। एक दिया हस्तक्षेप, सेल आकृति विज्ञान, और अभिव्यक्ति और परमाणु प्रतिलेखन कारक सहित प्रोटीन का स्थानीयकरण निम्नलिखित विशिष्ट एंटीबॉडी और एक छवि पी के साथ Immunofluorescent लेबलिंग का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता हैrocessing और विश्लेषण पैकेज।
Introduction
कंकाल की मांसपेशी की मरम्मत और उत्थान उपग्रह कोशिकाओं 1, myogenic स्टेम कोशिकाओं 2,3। की कार्रवाई की आवश्यकता है विवो इन कोशिकाओं को हर myofibre की sarcolemma और बेसल लामिना के बीच स्थित एक reversibly मौन राज्य में मौजूद हैं, लेकिन पैदा करने के लिए सक्रिय हो, फ्यूज और मांसपेशियों के ऊतकों के रूप में अंतर है, क्षतिग्रस्त मरम्मत और 3 पुनर्जीवित कर रहा है। उपग्रह कोशिकाओं enzymatic पाचन 4 का उपयोग युवा और बुजुर्ग मानव पेशी बायोप्सी नमूने और उनके myogenic गुणों से अलग किया जा सकता है बाद में प्राथमिक संस्कृति 5 में अध्ययन किया जा सकता है। सेल की आबादी के दोनों उपज और पवित्रता के संबंध में इस अलगाव की प्रक्रिया की दक्षता में इस्तेमाल किया तरीकों पर निर्भर करता है और नमूने के लिए नमूना से भिन्न हो सकते हैं। enzymatic पाचन से प्राप्त दो मुख्य पक्षपाती सेल प्रकार CD56 / + desmin कोशिकाओं, और म्यू के रूप में शुरू में पहचान उपग्रह कोशिकाओं (अब करार दिया myogenic कोशिकाओं या मांसपेशी अग्रदूत कोशिकाओं), कर रहे हैंscle व्युत्पन्न CD56 के रूप में पहचान fibroblasts, – और TE7 + कोशिकाओं 5। Fibroblasts एक तेजी से proliferative दर है और myogenic कोशिकाओं की तरह सेल सेल संपर्क पर अपरिवर्तनीय विकास गिरफ्तारी और टर्मिनल भेदभाव से गुजरना नहीं है; इस प्रकार मिश्रित आबादी में, fibroblasts के संस्कृति हावी करने के लिए myogenic कोशिकाओं उग सकता है।
Fibroblasts अक्सर हालांकि, अपने आप में अध्ययन के योग्य कोशिकाओं के रूप में fibroblasts में एक बढ़ती रुचि वे मांसपेशियों की मरम्मत 6 दौरान myogenic कोशिकाओं के साथ एक सहयोगी भूमिका है दिखाया गया है, खासकर के रूप में अब वहाँ है, मांसपेशियों में जीव के लिए एक जलन के रूप में देखा गया है । मानव पेशी से विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के अलगाव और शुद्धि इस प्रकार संस्कृति में दोनों प्रकार की कोशिकाओं का सहज व्यवहार की जांच के लिए कोशिश कर रहा है जब एक महत्वपूर्ण पद्धति विचार है। प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) कोशिकाओं को आगे के अध्ययन के लिए हल किया जा सकता है जिसके द्वारा एक विधि है और / या गिना औरविश्लेषण किया। FACS मज़बूती से मानव myogenic कोशिकाओं को समृद्ध करने के लिए दिखाया गया है, लेकिन बाद में संस्कृति के लिए कोशिकाओं की उपज इस प्रकार अब तक सात उच्च नहीं किया गया है। ऐसे वार्धक्य 4 के साथ जुड़े उपग्रह सेल व्युत्पन्न myogenic कोशिकाओं और बहुत ही गरीब प्रसार और भेदभाव के रूप में दैहिक कोशिकाओं के सीमित प्रतिकृति संभावित को देखते हुए अधिक कोमल दृष्टिकोण की आवश्यकता है। एक मांसपेशी फाइबर संस्कृतियों दूसरे, कम आक्रामक, उनके sublaminal आला में और संस्कृति 8,9 में उनकी सक्रियता के बाद अभी भी निवासी murine उपग्रह कोशिकाओं प्राप्त करने के साधन प्रदान करते हैं। बहरहाल, यह इस तकनीक मानव मांसपेशियों व्युत्पन्न कोशिकाओं का अध्ययन करने में रुचि कई अनुसंधान प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ नहीं हो सकता है जिसका अर्थ है कि (फाइबर शायद ही कभी कण्डरा को कण्डरा से प्राप्त किया जा सकता है क्योंकि) मानव पेशी बायोप्सी सामग्री से अक्सर संभव नहीं है। इसके अलावा, एक फाइबर तकनीक केवल बहुत सीमित सेल नंबर प्रदान करता है।
यहाँ हम जनरल पर आधारित छँटाई की एक प्रणाली का वर्णनTLE एंजाइमी कोलैजिनेज का उपयोग कोशिकाओं की पाचन और चुंबकीय सक्रिय सेल के लगातार दो राउंड छँटाई एक उच्च शुद्धता (> 95% myogenic कोशिकाओं) और उपज (~ दोनों देता है, जो (एमएसीएस) द्वारा पीछा dispase 2.8 एक्स 10 6 ± 8.87 x 10 5 कोशिकाओं / संस्कृति में प्रयोगों के लिए जी ऊतक)। CD56 सीटू 10 में और इन विट्रो 11 में मानव उपग्रह कोशिकाओं की पहचान के लिए स्वर्ण मानक सतह मार्कर माना जाता है और मनका कुर्की के लिए आदर्श सतह मार्कर उम्मीदवार प्रदान करता है। इस दृष्टिकोण में CD56 एंटीबॉडी लोहे के आक्साइड और पोलीसेकेराइड युक्त superparamagnetic मोती एक मजबूत चुंबकीय क्षेत्र 12,13 में रखा एक उच्च ढाल चुंबकीय सेल जुदाई कॉलम के माध्यम से कोशिकाओं के लिए बाध्य और पारित कर रहे हैं संयुग्मित। जुदाई स्तंभों मजबूत चुंबकीय क्षेत्र ढ़ाल (~ 4tesla) पैदा उनकी सतह की ओर चुंबकीय क्षेत्र लाइनों ध्यान केंद्रित करने की सेवा है, जो लौह-चुंबकीय इस्पात ऊन या लोहे के क्षेत्रों के एक मैट्रिक्स से भर रहे हैं 14। इन स्तंभों में भी थोड़ा चुंबकीय कोशिकाओं आकर्षित कर रहे हैं और उनकी सतह से 14 adsorbed। अनबाउंड (CD56 -) चुंबकीय microbeads के साथ लेबल CD56 + कोशिकाओं चुंबकीय क्षेत्र 12,15 से हटाने तक संभाल कर रखा जाता है, जबकि कोशिकाओं कॉलम के माध्यम से गुजरती हैं।
छँटाई प्रक्रिया के किसी भी स्तर से सेल निलंबन आगे प्रयोग के लिए वांछित घनत्व पर चढ़ाया जा सकता है। सेलुलर घटक immunocytochemistry का उपयोग कर पहचाना जा सकता है एक दिया हस्तक्षेप के बाद व्यापक क्षेत्र या confocal प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग imaged और किसी भी छवि में सभी लेबल की कोशिकाओं का तेजी से उद्देश्य माप की अनुमति देता है कि एक छवि विश्लेषण दृष्टिकोण का उपयोग मात्रात्मक विश्लेषण किया। Myogenic सेल, जबकि मानव fibroblasts आसानी adipocytes में transdifferentiate – हमारी प्रयोगशाला में हम उस CD56 प्रदर्शित करने के लिए छवि विश्लेषण 16 द्वारा पीछा इस दोहरे immunomagnetic छँटाई दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया हैउपग्रह मूल के इस adipogenic रूपांतरण करने के लिए 5 अत्यधिक प्रतिरोधी रहे हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम पेशी बायोप्सी सामग्री के छोटे नमूनों से मानव मांसपेशियों व्युत्पन्न व्यापारियों के चयनात्मक संवर्धन के लिए एक immunomagentic छँटाई प्रक्रिया का वर्णन किया है। इस तकनीक fibroblasts के लिए मानव मांसपेशियों व्युत्…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors wish to thank Carl Hobbs and Lindsey Majoram for their technical assistance, and Professor Pat Doherty for use of microscopy facilities. Dr. Agley was supported by a studentship from King’s College London. Funding from the Spurrell Trust is also acknowledged.
Materials
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | Must be filter sterilized before use |
| Trypsin/EDTA | (Gibco) Invitrogen | 15400-054 | |
| 100 micron cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| Collagen solution ( 3 mg/ml in 0.1% acetic acid) | Sigma, Dorset, UK | C8919 | |
| Minisart SRP15 syringe filter (0.2 micron) | Sartorius | 17573ACK | Polytetrafluorethylene (PTFE) membrane |
| CD56 human Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-050-401 | Be aware of the limited shelf life of microbeads |
| Anti- fibroblast Microbeads, human | Miltenyi Biotech | 130-050-601 | |
| 40 μm Pre-separation filters | Miltenyi Biotech | 130-041-407 | |
| Large Cell Collumns | Miltenyi Biotech | 130-042-202 | These columns come with a flow resistor. Use of the flow resistor is not necessary to obtain the high myogenic purities described here. |
| LS columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MiniMacs Seperator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | This separator fits the large cell column but not the LS column. |
| MidiMACS | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| BSA | Sigma | Must be filter sterilized before use | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| Triethyl phosphate | Sigma | 538728 | |
| Whatman Paper | Sigma | Z241121-1PAK | No. 42, Ashless. To prepare the filter fold the circular filter paper to make a semi circle, then fold the semi-circle in half again to form a cone shape. Fit the cone into a funnel for filtering. |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Molecular Probes, Invitrogen | P36930 | This can be purchased with or without DAPI and does not quench initial fluorescence. |
| AxioVision | Carl Zeiss | Contact Zeiss | |
| Adobe Photoshop CS5 Extended | Adobe (purchased from Pugh Computers) | ADPH16982* |
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