בידוד וכמוני Immunocytochemical אפיון של תאים ראשוניים myogenic וFibroblasts משרירי שלד אדם
Summary
The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.
Abstract
התיקון וההתחדשות של שריר שלד דורש הפעולה של תאי לווין, שהם תאי גזע שריר התושב. אלה יכולים להיות מבודדים מדגימות שריר אנושי ביופסיה באמצעות עיכול אנזימטי ומאפייני myogenic למדו בתרבות. כמותית, שני סוגי התאים חסיד העיקריים המתקבלים מעיכול אנזימטי הם: (i) תאי הלווין (המכונים תאי myogenic או תאי מבשר שריר), שזוהו בתחילה כCD56 + ובהמשך כCD56 + / desmin ותאים + (ii) שריר fibroblasts נגזר, שזוהה כCD56 – וTE-7 +. Fibroblasts להתרבות ביעילות רבה בתרבות ובאוכלוסיות תאים מעורבות תאים אלה עשויים מוצפים תאי myogenic להשתלט על התרבות. הבידוד וטיהור סוגי תאים שונים משריר האנושי שלו ובכך שיקול מתודולוגית חשוב כאשר מנסים לחקור את ההתנהגות המולדת של כל אחד מסוגי התאים בתרבית. כאן אנו descrIBE מערכת של מיון המבוסס על עיכול אנזימטי העדין של תאים באמצעות collagenase וdispase אחריו תא מופעל מגנטי מיון (MACS) אשר נותן שני טוהר גבוה (> תאי myogenic 95%) ותשואה טובה (~ 2.8 x 10 6 ± 8.87 x 10 5 תאים / g רקמות לאחר 7 ימים במבחנה) לניסויים בתרבות. גישה זו מבוססת על דוגרים אוכלוסיית תאים המעורבת נגזר שריר עם חרוזים microbeads מגנטיים המוצמדים לנוגדנים נגד CD56 ולאחר מכן עוברים תאים למרות ששדה מגנטי. CD56 + תאים חייבים microbeads נשמרים על ידי השדה ואילו CD56 – תאים עוברים ללא הפרעה דרך העמודה. השעיות תא מכל שלב של תהליך המיון יכולות להיות מצופים ותרבותית. בעקבות התערבות נתון, מורפולוגיה של תאים, והביטוי והלוקליזציה של חלבונים כוללים גורמי שעתוק גרעיניים ניתן לכמת באמצעות תיוג immunofluorescent עם נוגדנים ספציפיים וp תמונהrocessing וחבילת ניתוח.
Introduction
התיקון וההתחדשות של שריר שלד דורש הפעולה של תאי לווין 1, תאי גזע myogenic 2,3. בvivo תאים אלה קיימים במדינה הפיכה שקטה הממוקמת בין sarcolemma וlamina בסיס של כל myofibre, אלא הופכים להיות מופעל כדי להתרבות, פתיל ולהבדיל כרקמת שריר פגום, תיקון ומחדש 3. יכולים להיות מבודדים תאי לווין מדגימות צעירות וקשישים שריר אנושי ביופסיה באמצעות עיכול אנזימטי 4 ומאפייני myogenic לאחר מכן ניתן יהיה למד בתרבות העיקרית 5. היעילות של תהליך בידוד זה בהקשר לשתי התשואה והטוהר של אוכלוסיית תאים תלויה בשיטות ויכולה להשתנות ממדגם לדגום. שני סוגי התאים חסיד העיקריים המתקבלים מעיכול אנזימטי הם תאי הלווין (תאי myogenic עכשיו כינו או תאי מבשר שריר), שזוהו בתחילה כתאי CD56 + / desmin, וmufibroblasts הנגזר scle, זוהה כCD56 – וTE7 + תאי 5. לפיברובלסטים שיעור שגשוג מהיר ולא יעברו מעצר בלתי הפיך צמיחה ובידול מסוף במגע תאי תאים כמו תאי myogenic; כך באוכלוסיות מעורבות, fibroblasts עשוי מוצף תאי myogenic להשתלט על התרבות.
לעתים קרובות נצפה fibroblasts כגירוי לביולוגים שריר, לעומת זאת, יש כיום עניין גובר בfibroblasts כתאים ראויים למחקר בפני עצמם, במיוחד כשהם הוכחו יש להם תפקיד של שיתוף פעולה עם תאי myogenic במהלך תיקון שריר 6 . הבידוד וטיהור סוגי תאים שונים משריר האנושי שלו ובכך שיקול מתודולוגית חשוב כאשר מנסים לחקור את ההתנהגות המולדת של שני סוגי התאים בתרבית. מיון תא הקרינה המופעל (FACS) הוא שיטה שבאמצעותה ניתן למיין תאים למחקר נוסף ו / או וספרניתח. FACS הוכח להעשיר באופן מהימן תאי myogenic אנושיים, אבל התשואה של תאים לתרבות שלאחר מכן עד כה לא הייתה גבוהה 7. לאור פוטנציאל השכפול המוגבל של תאים סומטיים כגון תאים נגזרים תאי לווין myogenic ועני מאוד התפשטות ובידול הקשורים להזדקנות 4, גישות עדינות יותר נדרשות. תרבויות סיב שריר בודדות מציעות אחר, פחות אגרסיווי, אמצעי להשגת תאי לווין עכבריים עדיין תושב בנישה sublaminal ולאחר ההפעלה שלהם בתרבות 8,9. עם זאת, זה בדרך כלל לא אפשרי מחומר ביופסיה של שריר אדם (כי רק לעתים נדירות ניתן להשיג מגיד לגיד סיבים) כלומר טכניקה זו עשויה שלא להיות נגישה למעבדות מחקר רבות מעוניינים ללמוד תאים שמקורם בשרירים אנושיים. יתר על כן, טכניקת הסיב בודדת מספקת רק מספרים סלולריים מוגבלים מאוד.
כאן אנו מתארים מערכת של מיון המבוסס על genעיכול אנזימטי tle של תאים באמצעות collagenase וdispase אחרי שני סיבובים רצופים של תא מופעל מגנטי מיון (MACS) אשר נותן שני טוהר גבוה (> תאי myogenic 95%) ותשואה (~ 2.8 x 10 6 ± 8.87 x 10 5 תאים / רקמת ז) לניסויים בתרבות. CD56 נחשב סמן משטח תקן זהב לזיהוי של תאי לווין אנושיים באתר 10 ובמבחנה 11 ומספק מועמד סמן משטח האידיאלי עבור קובץ מצורף חרוז. בגישה זו נוגדני CD56 מוצמדים לתחמוצת ברזל וחרוזים פאראמגנטי המכיל פוליסכריד חייב תאים ועבר דרך עמודת הפרדת תא מגנטית גבוהה שיפוע מונחת בשדה מגנטי חזק 12,13. עמודי ההפרדה מלאים במטריצה של תחומים צמר פלדה או ברזל פרומגנטיים המשמשים להתמקד קווי שדה מגנטיים לכיוון פני השטח שלהם יצירת שיפועים חזקים שדה מגנטי (~ 4tesla) 14. בטורים אלה אפילו תאים מעט מגנטיים נמשכים ושנספחו לפני השטח שלהם 14. Unbound (CD56 -) תאים עוברים דרך הטור ואילו + תאי CD56 שכותרתו עם microbeads המגנטי נשמרים עד לסילוקו מהשדה המגנטי 12,15.
השעיות תא מכל שלב של תהליך המיון יכולות להיות מצופים בצפיפות הרצויה לניסויים נוספים. בעקבות התערבות נתון ניתן לזהות את המרכיבים התאיים באמצעות immunocytochemistry, צילם באמצעות שדה רחב או מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal ונותח כמותית באמצעות גישת ניתוח תמונה המאפשרת מדידה אובייקטיבית מהירה של כל התאים שכותרתו בכל תמונת נתונה. במעבדה שלנו יש לנו השתמשתי בגישת מיון immunomagnetic זה כפול ואחרי ניתוח תמונה 16 להפגין CD56 ש– fibroblasts אדם transdifferentiate בקלות לתוך תאי שומן, תוך תא myogenicים ממוצא הלווין עמיד מאוד בפני המרת adipogenic זה 5.
Protocol
Representative Results
Discussion
שתארנו הליך מיון immunomagentic להעשרה סלקטיבית של מבשרים המופק משריר אנושיים מדגימות קטנות של חומר ביופסיה של שריר. טכניקה זו כבר לא יסולא בפז במעבדה שלנו להתגברות על האובדן של תרבויות המופק משריר האנושיים לfibroblasts, אלא גם להבנת ההתנהגות הייחודית של אוכלוסיות שונות של אבות…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors wish to thank Carl Hobbs and Lindsey Majoram for their technical assistance, and Professor Pat Doherty for use of microscopy facilities. Dr. Agley was supported by a studentship from King’s College London. Funding from the Spurrell Trust is also acknowledged.
Materials
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | Must be filter sterilized before use |
| Trypsin/EDTA | (Gibco) Invitrogen | 15400-054 | |
| 100 micron cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| Collagen solution ( 3 mg/ml in 0.1% acetic acid) | Sigma, Dorset, UK | C8919 | |
| Minisart SRP15 syringe filter (0.2 micron) | Sartorius | 17573ACK | Polytetrafluorethylene (PTFE) membrane |
| CD56 human Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-050-401 | Be aware of the limited shelf life of microbeads |
| Anti- fibroblast Microbeads, human | Miltenyi Biotech | 130-050-601 | |
| 40 μm Pre-separation filters | Miltenyi Biotech | 130-041-407 | |
| Large Cell Collumns | Miltenyi Biotech | 130-042-202 | These columns come with a flow resistor. Use of the flow resistor is not necessary to obtain the high myogenic purities described here. |
| LS columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MiniMacs Seperator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | This separator fits the large cell column but not the LS column. |
| MidiMACS | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| BSA | Sigma | Must be filter sterilized before use | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| Triethyl phosphate | Sigma | 538728 | |
| Whatman Paper | Sigma | Z241121-1PAK | No. 42, Ashless. To prepare the filter fold the circular filter paper to make a semi circle, then fold the semi-circle in half again to form a cone shape. Fit the cone into a funnel for filtering. |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Molecular Probes, Invitrogen | P36930 | This can be purchased with or without DAPI and does not quench initial fluorescence. |
| AxioVision | Carl Zeiss | Contact Zeiss | |
| Adobe Photoshop CS5 Extended | Adobe (purchased from Pugh Computers) | ADPH16982* |
Referências
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibres. J. Cell Biol. 9, 493-495 (1961).
- Hawke, T. J., Garry, D. J. Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology. J. Appl. Physiol. 91, 534-551 (2001).
- Yin, H., Price, F., Rudnicki, M. A. Satellite Cells and the Muscle Stem Cell Niche. Physiol. Rev. 93, 23-67 (2013).
- Alsharidah, M., et al. Primary human muscle precursor cells obtained from young and old donors produce similar proliferative, differentiation and senescent profiles in culture. Aging Cell. 12, 333-344 (2013).
- Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. R., Harridge, S. D. R. Human skeletal muscle fibroblasts, but not myogenic cells, readily undergo adipogenic differentiation. J. Cell Sci. 126, 5610-5625 (2013).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138, 3625-3637 (2011).
- Webster, C., Pavlath, G. K., Parks, D. R., Walsh, F. S., Blau, H. M. Isolation of human myoblasts with the fluorescence-activated cell sorter. Exp. Cell Res. 174, 252-265 (1988).
- Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle. J. Vis Exp. , e50074 (2013).
- Kuang, S., Kuroda, K., Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Asymmetric Self-Renewal and Commitment of Satellite Stem Cells in Muscle. Cell. 129, 999-1010 (2007).
- Mackey, A. L., et al. Assessment of satellite cell number and activity status in human skeletal muscle biopsies. Muscle a d Nerve. 40, 455-465 (2009).
- Stewart, J. D., et al. Characterization of proliferating human skeletal muscle-derived cells in vitro: Differential modulation of myoblast markers by TGF-β2. J. Cell. Physiol. 196, 70-78 (2003).
- Miltenyi, S., Müller, W., Weichel, W., Radbruch, A. High gradient magnetic cell separation with MACS. Cytometry. 11, 231-238 (1990).
- Clarke, C., Davies, S., Brooks, S. A., Schumacher, U. Ch. 2. Methods in Molecular Medicine. Metastasis Research Protocols. 58, 17-23 (2001).
- Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A, 643-647 (2010).
- Tomlinson, M. J., Tomlinson, S., Yang, X. B., Kirkham, J. Cell separation: Terminology and practical considerations. Journal of Tissue Engineering. 4, (2013).
- Agley, C. C., Velloso, C. P., Lazarus, N. R., Harridge, S. D. R. An Image Analysis Method for the Precise Selection and Quantitation of Fluorescently Labeled Cellular Constituents: Application to the Measurement of Human Muscle Cells in Culture. J. Histochem. Cytochem. 60, 428-438 (2012).
- Danoviz, M., Yablonka-Reuveni, Z., DiMario, J. X. Ch. 2. Methods in Molecular Biology. Myogenesis. 798, 21-52 (2012).
- Bergström, J. Muscle electrolytes in man. Determined by neutron activation analysis on needle biopsy specimens. A study on normal subjects, kidney patients, and patients with chronic diarrhoea. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 14, 7-100 (1962).
- Chazaud, B., et al. Satellite cells attract monocytes and use macrophages as a support to escape apoptosis and enhance muscle growth. The Journal of Cell Biology. 163, 1133-1143 (2003).
- Abou-Khalil, R., et al. Autocrine and Paracrine Angiopoietin 1/Tie-2 Signaling Promotes Muscle Satellite Cell Self-Renewal. Cell Stem Cell. 5, 298-309 (2009).
- Timpl, R., Kvonder Mark, . Role of laminin and fibronectin in selecting myogenic versus fibrogenic cells from skeletal muscle cells in. 117, 628-635 (1986).
- Lichtman, J. W., Conchello, J. -. A. Fluorescence microscopy. Nat Meth. 2, 910-919 (2005).
- Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. Optimisation of oil red O staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids. Histochem. Cell Biol. 116, 63-68 (2001).
- Rossner, M., Yamada, K. M. What’s in a picture? The temptation of image manipulation. The Journal of Cell Biology. 166, 11-15 (2004).
- Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O. Recent advances in quantitative colocalization analysis: Focus on neuroscience. Prog. Histochem. Cytochem. 44, 125-172 (2009).
- Johnson, J. Not seeing is not believing: improving the visibility of your fluorescence images. Mol. Biol. Cell. 23, 754-757 (2012).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 185, 1135-1148 (2009).
- Pawley, J. The 39 steps: A cautionary tale of quantitative 3-D fluorescence microscopy. Biotechniques. 28, 884-887 (2000).
- Bolte, S., Cordelières, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224, 213-232 (2006).
- Brown, C. M. Fluorescence microscopy – avoiding the pitfalls. J. Cell Sci. 120, 1703-1705 (2007).
- Bareja, A., et al. Human and Mouse Skeletal Muscle Stem Cells: Convergent and Divergent Mechanisms of Myogenesis. PLoS ONE. 9, e90398 (2014).
- Castiglioni, A., et al. Isolation of Progenitors that Exhibit Myogenic/Osteogenic Bipotency In by Fluorescence-Activated Cell Sorting from Human Fetal Muscle. Stem Cell Reports. 2, 560 (2014).
- Fukada, S. -. i., et al. CD90-positive cells, an additional cell population, produce laminin α2 upon transplantation to dy3k/dy3k mice. Exp. Cell Res. 314, 193-203 (2008).
- Stickland, N. Muscle development in the human fetus as exemplified by m. sartorius: a quantitative study. J. Anat. 132, 557-579 (1981).
