Isolatie en Kwantitatieve Immunocytochemische karakterisering van primaire Myogene cellen en fibroblasten van Human Skeletal Muscle

Het herstel en regeneratie van de skeletspier vereist de actie van satelliet-cellen ^1, de myogene stamcellen ^2,3. In vivo deze cellen bestaan ​​in een reversibel rusttoestand gelegen tussen de sarcolemma en basale lamina van elke myofibre, maar geactiveerd worden om te woekeren, zekering en differentiëren spierweefsel beschadigd, gerepareerd en geregenereerd ^3. Satelliet-cellen kunnen worden geïsoleerd uit jonge en oudere humane spierbiopsie monsters middels enzymatische digestie ⁴ en de myogene eigenschappen kunnen vervolgens worden onderzocht in primaire kweek ^5. De efficiëntie van dit isolatieproces met betrekking tot zowel opbrengst en zuiverheid van de celpopulatie afhankelijk van de gebruikte methoden en kunnen verschillen van monster tot monster. De twee belangrijkste aanhanger celtypen verkregen van enzymatische afbraak zijn de satelliet cellen (nu genoemd myogene cellen of spier voorloper cellen), aanvankelijk geïdentificeerd als CD56 ⁺ / desmine cellen, en mu-SCLE afgeleide fibroblasten, geïdentificeerd als CD56 ^– en TE7 ⁺ cellen ^5. Fibroblasten hebben een snelle proliferatieve tarief en geen onomkeerbare groeistop en terminale differentiatie op cel-cel contact achtige myogene cellen niet ondergaan; dus in gemengde populatie, kan fibroblasten myogene cellen overspoeld met de cultuur domineren.

Fibroblasten vaak gezien als een irritatie voor spier biologen, maar er is nu een groeiende interesse in fibroblasten als cellen waard studie op zich, vooral omdat zij aangetoond dat een coöperatieve rol myogene cellen tijdens spier herstel ⁶ . De isolatie en zuivering van verschillende celtypen van menselijke spier is dus een belangrijke methodologische overweging wanneer het proberen om de aangeboren gedrag van beide celtypen in kweek te onderzoeken. Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) is een methode waarbij cellen kan worden gesorteerd voor verdere studie en / of geteld engeanalyseerd. FACS is aangetoond betrouwbaar verrijken menselijke myogene cellen, maar de opbrengst aan cellen voor verdere kweek is vooralsnog niet hoog ⁷ geweest. Gezien de beperkte replicatie potentieel van somatische cellen, zoals satelliet-cel-afgeleide myogene cellen en de zeer slechte proliferatie en differentiatie in verband met veroudering ^4, zijn meer zachte aanpak vereist. Single spiervezels culturen bieden een andere, minder agressief, betekent het verkrijgen van muizen satelliet-cellen nog in hun sublaminal niche en na hun activering in cultuur ^8,9 inwoner. Dit is echter vaak niet mogelijk uit menselijke spierbiopsie materiaal (omdat vezels nauwelijks zijn te verkrijgen pees pees) waardoor deze techniek niet toegankelijk voor veel onderzoekslaboratoria geïnteresseerd om menselijke spier afgeleide cellen zijn. Bovendien is de enkele vezel techniek maar korte tijd celaantallen.

Hier een sorteersysteem gebaseerd op het gen beschrijven weTLE enzymatische digestie cellen met collagenase en dispase gevolgd door twee opeenvolgende ronden van magnetisch geactiveerde celsortering (MACS) dat zowel een hoge zuiverheid (> 95% myogene cellen) en opbrengst (~ geeft 2,8 x 10 ⁶ ± 8.87 x 10 ⁵ cellen / g weefsel) voor experimenten in de cultuur. CD56 wordt beschouwd als de gouden standaard oppervlak marker voor de identificatie van menselijke satelliet cellen in situ ¹⁰ pt in vitro ¹¹ en de ideale oppervlaktemerker kandidaat voor kralen bevestiging. In deze benadering CD56 antilichamen geconjugeerd aan ijzeroxide en polysaccharide bevattende superparamagnetische gebonden aan cellen en door een hooggradiënte magnetische celscheidingskolom geplaatst in een sterk magnetisch veld ^12,13. De scheiding kolommen zijn gevuld met een matrix van ferromagnetische staalwol of ijzeren bolletjes die dienen om magnetische veldlijnen zich aan hun oppervlak die sterke magnetische veld gradiënten (~ 4tesla) ¹⁴. In deze kolommen zelfs licht magnetische cellen worden aangetrokken en geadsorbeerd aan het oppervlak ^14. Ongebonden (CD56 ^-) cellen passeren de kolom terwijl CD56 ⁺ cellen gelabeld met magnetische microbolletjes worden behouden tot verwijdering uit het magnetische veld ^12,15.

Celsuspensies van elke fase van het sorteerproces kan worden geplateerd op de gewenste dichtheid voor verdere experimenten. Naar aanleiding van een bepaalde interventie van de cellulaire bestanddelen kunnen worden geïdentificeerd met behulp van immunocytochemie, afgebeeld met behulp van wide-field of confocale fluorescentie microscopie en kwantitatief geanalyseerd met behulp van een beeldanalyse aanpak die een snelle objectieve meting van alle gelabelde cellen in een bepaalde afbeelding maakt. In ons laboratorium hebben we deze dubbele immunomagnetische sortering benadering gevolgd door beeldanalyse ¹⁶ gebruikt om dat CD56 te tonen ^– de menselijke fibroblasten gemakkelijk transdifferentiëren tot adipocyten, terwijl myogenic cels satelliet oorsprong zijn zeer resistent tegen deze adipogene omzetting ^5.