Isolering og kvantitativ Immuncytokemisk karakterisering af primære myogene celler og fibroblaster fra human skeletmuskel

Reparationen og regenerering af skeletmuskulatur kræver handling af satellit celler ^1, de myogene stamceller ^2,3. In vivo findes disse celler i en reversibelt hvilende tilstand placeret mellem sarcolemma og basal lamina af hver myofibre, men bliver aktiveret til at formere sig, sikring og differentiere som muskelvæv er beskadiget, repareret og regenereret ^3. Satellit-celler kan isoleres fra unge og ældre human muskel biopsiprøver under anvendelse af enzymatisk fordøjelse ⁴ og deres myogene egenskaber kan efterfølgende undersøgt i primær kultur ^5. Effektiviteten af ​​denne isolation proces med hensyn til både udbytte og renhed af cellepopulation afhænger af de anvendte metoder og kan variere fra prøve til prøve. De to vigtigste vedhængende celletyper opnået fra enzymatisk nedbrydning er satellit celler (nu betegnet myogene celler eller muskel præcursorceller), først identificeret som CD56 ⁺ / desmin celler og muSCLE-afledte fibroblaster, identificeret som CD56 ^– og TE7 ⁺ celler ^5. Fibroblaster har en hurtig proliferativ sats og ikke undergår irreversibel vækststandsning og terminal differentiering ved celle-celle-kontakt som myogene celler; således i blandede populationer, kan fibroblaster overskredet myogene celler at dominere kulturen.

Fibroblaster er ofte blevet set som en irritation i muskelvæv biologer, men der er nu en stigende interesse for fibroblaster som celler værd at studere i deres egen ret, især fordi de har vist sig at have en kooperativ rolle med myogene celler under muskel reparation ⁶ . Isoleringen og oprensning af forskellige celletyper fra human muskel er således et vigtigt metodiske overvejelser, når de forsøger at undersøge medfødte adfærd begge celletyper i kultur. Fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) er en metode, ved hvilken celler kan sorteres til yderligere undersøgelse og / eller tælles oganalyseret. FACS har vist sig at pålideligt berige humane myogene celler, men udbyttet af celler til efterfølgende kultur har hidtil ikke været høj ^7. I betragtning af den begrænsede replikationspotentiale af somatiske celler, såsom satellit-celleafledt myogene celler og meget dårlig proliferation og differentiering er forbundet med senescens ⁴ er mere skånsom metoder påkrævet. Enkelte kulturer muskel fiber tilbyde en anden, mindre aggressive, midler til at opnå murine satellit celler stadig bosat i deres sublaminal niche, og efter deres aktivering i kultur ^8,9. Dette er imidlertid ofte ikke muligt fra human muskel biopsi materiale (fordi fibre sjældent kan opnås fra senen til sene) betyder, at denne teknik ikke kan være tilgængelige for mange forskningslaboratorier interesserede i at studere human muskel-afledte celler. Desuden enkelt fiber teknik kun giver meget begrænsede celletal.

Her beskriver vi et system med sortering baseret på gentle enzymatisk fordøjelse af celler under anvendelse af collagenase og dispase efterfulgt af to på hinanden følgende runder af magnetisk cellesortering (MACS), hvilket giver både en høj renhed (> 95% myogene celler) og udbytte (~ 2,8 x 10 ⁶ ± 8,87 x 10 ⁵ celler / g væv) til forsøg i kultur. CD56 betragtes som den gyldne standard overflade markør for identifikation af humane satellit celler in situ ¹⁰ og in vitro ¹¹ og giver den ideelle overflade markør kandidat til perle fastgørelse. Ved denne fremgangsmåde CD56 antistoffer konjugeret til jernoxid og polysaccharid indeholdende superparamagnetiske kugler bundet til celler og ledes gennem en høj gradient magnetisk celleseparering kolonne anbringes i et stærkt magnetisk felt ^12,13. Separationskolonnerne er fyldt med en matrix af ferromagnetiske ståluld eller jern kugler, der tjener til at fokusere magnetiske feltlinier mod deres overflade genererer stærke magnetiske feltgradienter (~ 4tesla) ¹⁴. I disse kolonner endda lidt magnetiske celler er tiltrukket og adsorberet til overfladen ^14. Ubundet (CD56 ^-) celler passerer gennem kolonnen mens CD56 ⁺ celler mærket med magnetiske mikroperler bevares indtil fjernelse fra magnetfeltet ^12,15.

Cellesuspensioner fra enhver fase af sortering proces kan være belagt på den ønskede densitet for yderligere eksperimenter. Efter en given indsats de cellulære bestanddele kan identificeres ved hjælp af immuncytokemi, afbildes ved hjælp af bredt område eller konfokal fluorescensmikroskopi og analyseret kvantitativt ved hjælp af en billedanalyse, der tillader en hurtig objektiv måling af alle mærkede celler i et givet billede. I vores laboratorium har vi brugt denne dobbelte immunomagnetisk sortering indflyvning efterfulgt af billedanalyse ¹⁶ at vise, at CD56 ^– humane fibroblaster let transdifferentiate til adipocyter, mens myogenic celles af satellit oprindelse er meget modstandsdygtige over for denne adipogeniske konvertering ^5.