Methoden om subcellulaire compartimenten van Muscle beoordelen<em> C. elegans</em

Deze methoden kan de verkenning van de spieren van de macrophysiology van beweging om het identificeren van subcellulaire gebreken die voldoende is om een ​​beweging defect veroorzaken. Toen combineerde deze methoden is het mogelijk een gedetailleerde analyse van de spier. Het inzicht verworven laat verder testen van spier-georiënteerde hypothesen die betrekking hebben op de algemene fysiologie, pathofysiologie en veroudering.

Beweging Testen

Een beweging defect duidt op een verstoring van de normale neuromusculaire functie. Dit kan specifiek zenuwen of spieren of kan gemeenschappelijk zijn tussen verschillende weefsels. Het moeilijkste fasen van de voltooiing van de beweging testen worden selecteren wormen die representatief zijn voor de bevolking en / of de behandeling zijn, en zorgen dat de onderzoeker het dier niet verwonden bij overdracht naar M9. Het is belangrijk om een ​​grote steekproef een representatieve en nauwkeurige vaststelling van de beweging te verkrijgen zijn. Bij het testen van zeer penetrant effecten, bijvoorbeeld zoals vaak gezien in mutanten, een steekproefomvang van tien dieren per getoetst beweging tienmaal voldoende om statistisch significante verschillen ten opzichte van wild-type vinden. Echter, de eenvoud van beweging assays en het gemak van het kweken van C. elegans betekenen dat honderden wormen snel kunnen worden beoordeeld om kwantitatief robuuste resultaten te garanderen. Bij testen effecten die in slechts een gedeelte van een bevolking blijken is het belangrijk te bepalen welk deel van de bevolking blijkt ook worden beïnvloed als de ernst van defecten in de getroffen dieren. In dergelijke situaties grotere aantallen dieren moeten worden beoordeeld met het oog op de minimale gegevens voor deel van de getroffen bevolking. Vaak zowel geneesmiddel als RNAi behandelingen hevige beweging defecten produceren een klein deel van de bevolking. In sommige gevallen verhogen van de dosis van de behandeling en of de wijze van levering zal het aandeel van AFF vergrotenecteerd dieren lopen dosis respons curves kan nuttig zijn om de optimale concentratie van een geneesmiddel of RNAi zijn. Een tweede beperking van deze beweging assay is dat de wormen worden gemanipuleerd om beweging te beoordelen. Dus de wormen stimuleerde en onderworpen aan enige mate van osmotische stress geplukt in vloeistof. De mate van osmotische stress kan worden beperkt door gebruik M9 of BU buffer ¹⁹ in plaats van water. Sommige van deze beperkingen worden verlicht door het meten van gewone beweging op platen met behulp van commercieel beschikbare volgsystemen ³⁴ of gratis plug ins voor ImageJ ^35. Het meten van de bewegingssnelheid van een dier kan belangrijke informatie over algemene gezondheid spier, waaronder veranderingen in functie die kan worden gemeten gedurende de levensduur en de niet-invasieve Deze methode sleutel voor toekomstige levenslange onderzoeken van spierfunctie verschaffen.

Beeldvorming van de Contractiele Apparatus

Het is essentieel om de wormen nauwlettend nadat het dekglaasje werd geïntroduceerd als de druk uiteindelijk stijgen genoeg om de wormen delen barsten van overdruk, gewoonlijk 10-15 minuten na coverslip toevoeging. Extra buffer kan worden ingebracht met behulp van een pipet tip rond de randen van het dekglaasje aan verbrijzelingsletsel de wormen te voorkomen. Nagellak kan worden gebruikt om de randen van het dekglaasje dichten en verdamping te voorkomen, hoewel dit voorkomt het ophalen van dieren onder dekglas, indien gewenst. Evenzo kan het gebruik van siliconen kralen in de oplossing te helpen de druk het dekglaasje plaatsen op de wormen verminderen.

Net als bij de beoordeling van een beweging defect, is het belangrijk om de penetratie van effect overwegen. Penetrantie kan hoog worden overwogen als 80-100% dieren vertonen een fenotype op de NGM plaat, gedeeltelijke of 21-79% en laag indien ≤20% van het display bevolking een invloed. Voor zeer penetrant effecten, kunnen kleinere steekproefomvang worden gebruikt om belangrijke kwantitatieve gegevens over sarcomeer defecten te produceren. Wanneer het effect een lage penetrantie, selectie van dieren met een duidelijke beweging defect weergegeven in reactie op het geneesmiddelof RNAi behandeling kan nuttig zijn bij het bepalen van sarcomeer afwijkingen bij dieren het meest beïnvloed door de behandeling. Het is echter niet noodzakelijkerwijs het geval dat de mate van behandelingseffect verplaatsing en subcellulaire structuur is hetzelfde. Aldus kan het gewenst zijn, worden de mate van afwijkingen in de grote populatie, bijvoorbeeld 100 dieren. Hierdoor begrip van de verdeling van defecten gedurende een populatie. Het kan ook wenselijk zijn om de omvang van de afwijking onderzoeken de zwaarst getroffen dieren en / of onderzoekt de correlatie tussen de mate van sarcomeer gebrek en bewegingsafstand defect. Potentiële problemen terzijde, deze methode is sneller en gemakkelijker dan andere wijze te sarcomeer structuur. Deze snelheid en het gemak is echter onderhevig aan een belangrijke beperking, sarcomeres met GFP fusie-eiwitten zijn niet helemaal normaal ³⁷ en dus de beoordeling van de verstoorde sarcomeres moet worden bevestigd met behulp van extra meer arbeidsintensieve methoden.Deze methoden omvatten het gebruik van gepolariseerd licht ^38, phalloidin kleuring ^39, en indirecte immunofluorescentie ^40. Van deze methoden, maar gepolariseerd licht is relatief niet-invasieve; de andere methoden vereisen fixatie en bijgevolg niet kunnen worden gebruikt in prospectieve studies van individuele dieren, liever ze kunnen alleen worden gebruikt om te bevestigen, steken doorsnede, de resultaten van deze studies.

Beeldvorming van mitochondriale Networks

De worm virusstam die bij de mitochondriale imaging experimenten was CB5600 ⁷ die een GFP-fusie-eiwit gelokaliseerd in de mitochondriën en een GFP β-galactosidase-fusie-eiwit gelokaliseerd in de kern uitdrukt, zowel in de lichaamswand spieren. Zoals met gebruik van PJ727 voor beeldvorming sarcomeres gebruik van deze stam maakt visualisatie van mitochondriale netwerkstructuur in levende dieren. Aldus kan deze stam gebruikt worden om dynamische veranderingen die optreden beoordelen, bijvoorbeeld verminderde mitochondrial fusion en / of verhoogde mitochondriale kernsplijting ^41. Ook voor beeldvorming sarcomeres de grootste problemen met deze methode is dat de wormen te beelden nog in leven en bewegen, waardoor het moeilijk doelgerichte beelden krijgen. Hoewel verschillende werkwijzen, zoals hieronder in meer detail beschreven, kunnen worden gebruikt om beweging te verminderen, mitochondria blijken bijzonder gevoelig voor interventies verminderde beweging veroorzaken. Bijvoorbeeld meest gebruikte anesthetica doelwitcomponenten van de mitochondriale ademhalingsketen en derhalve moet worden gebruikt bij studies van normale mitochondriale structuur en functie. Op dezelfde manier moeten de meeste verlamde agenten met voorzichtigheid worden gebruikt in studies van de normale mitochondriale structuur en functie, zoals de meeste verlamde agenten veroorzaken minder signaal via de neuromusculaire overgang en functionele denervatie van de spier door te geven is voldoende om mitochondriale fragmentatie veroorzaken. De experimenten in deze studie toegepaste druk dierlijke immobiliserens maar anderen hebben met succes gebruik levamisol ^42, maar het is van essentieel belang om het dier onmiddellijk.

Tenslotte verschillende bacteriële verontreinigingen in kweken, bijvoorbeeld B. subtilis, kan mitochondriale fragmentatie induceren; Daarom is het noodzakelijk om geschikte onbehandelde controles in de analyse. Voor zeer penetrant effecten, kunnen kleinere steekproefomvang worden gebruikt om belangrijke kwantitatieve gegevens over mitochondriale netwerk defecten te produceren. Vanwege de prevalentie van kleine defecten in het mitochondriaal netwerk dit kleine aantal dieren waarschijnlijk aan tweemaal het aantal nodig voor de beoordeling van sarcomeer structuur. Wanneer het effect een lage penetrantie kan selectie dieren duidelijk weergeven van een beweging defect in reactie op geneesmiddelen of RNAi behandeling nuttig testen mitochondriale aandoeningen bij dieren zwaarst door de behandeling. Zoals hierboven vermeld, is het niet noodzakelijk zo dat deomvang van behandelingseffect verplaatsing en subcellulaire structuur is hetzelfde. Aldus kan het gewenst zijn, worden de mate van afwijkingen in de grote populatie, bijvoorbeeld 150-200 dieren, alsmede de mate van verstoring van de zwaarst aangetaste dieren en de aanwezigheid of afwezigheid van mate van verstoring met mate beweging defect. Andere stammen met fluorescent gelabelde mitochondriën kan worden gebruikt om de resultaten verkregen CB5600 bevestigen, is het gebruik van verschillende fluorescente eiwitten de basislijn netwerken van mitochondria beïnvloeden. Zo wordt het gebruik van een TOMM RFP-20 fusieproteïne mitochondriën visualiseren veroorzaken verhoogde basislijn mitochondriale fragmentatie versus het gebruik van mitochondriaal gelokaliseerd GFP ^17. Terwijl andere methoden zoals immunofluorescentie en elektronenmicroscopie worden gebruikt om mitochondriale structuur bepalen, behoeven derhalve niet in vivo beoordeling van mitochondriale dynamiek mogelijk omdat fixatie stap vereisend. Andere werkwijzen zoals het gebruik van mitochondriaal gelokaliseerde kleurstoffen kunnen zonder fixatie worden gebruikt en dus kunnen worden gebruikt in plaats van gebruik van mitochondriaal gelokaliseerd GFP. Zoals besproken in de volgende sectie, gebruik van deze kleurstoffen maakt ook ruwe beoordeling van in vivo mitochondriale functie.

Het beoordelen van mitochondriale membraan Potentiële In Vivo de C. elegans

Verschillende kleurstoffen beschikbaar voor etikettering mitochondria ^28. Deze kleurstoffen een alternatieve visualiseren mitochondriale netwerkstructuur in levende C. elegans. Veel van deze kleurstoffen eveneens mogelijk ruwe beoordeling van mitochondriale functie in vivo, omdat zij accumuleren in mitochondria basis van de mitochondriale membraanpotentiaal. Hier hebben we gebruikt C ₃₂ H ₃₂ Cl ₂ N ₂ O, die wordt ingenomen doorhet spijsverteringskanaal, met enkele extra invoeren van de worm via de cuticula vanwege de permeabilisatie geboden door opgelost in 0,5% DMSO. Na binnenkomst in de cel C ₃₂ H ₃₂ Cl _{2 N2O} geoxideerd en afgezonderd door de mitochondriën, waar het bindt zwavelhoudende aminozuren (bijvoorbeeld methionine en cysteine). De vorming van deze kleurstof-peptidecomplexen betekent C ₃₂ H ₃₂ Cl ₂ N ₂ O blijft de mitochondria eenmaal gelabelde ^28. Een belangrijk probleem bij het gebruik van mitochondriale kleurstoffen is dat ze allemaal mitochondriën zullen etiketteren in het dier. Daarom hebben we uitgevoerd etikettering CB5600, dezelfde stam hierboven beschreven voor de beoordeling spier mitochondriale netwerkstructuur. Door een rode mitochondriale kleurstof, een stam van wormen die GFP in mitochondriële en een triple pass filter, is het relatief eenvoudig om het alleen mitochondria in spieren door het vinden mitochondriën die obereik door colocalization van rode kleurstof en GFP gelabelde mitochondriën. De moeilijkste stap in het uitvoeren van deze colocalization aanpak is beeldvorming, omdat de kleurstof is foto-gebleekt binnen enkele seconden onder hoge intensiteit TL-licht. Dit effect kan worden beperkt door het houden van de fluorescentie op laag vermogen totdat de onderzoeker is klaar te en dienovereenkomstig aanpassen van de fluorescentie-intensiteit. Zodra men ervaren met het gebruik van kleurstoffen andere benadering is om confocale microscopie met Z-stapels alleen beeld mitochondria in het juiste weefsel te gebruiken; de mitochondriale netwerken spieren zijn zeer verschillend in vergelijking met andere weefsels. Helaas, het onvermogen van C ₃₂ H ₃₂ Cl ₂ N ₂ O mitochondria ²⁸ verlaten betekent dat, in tegenstelling tot het sarcomeer en mitochondriale beeldvormingstechnieken hierboven besproken, kan het niet worden gebruikt om prospectief volgen verlies van mitochondriale functie, tenzij C ₃₂ H ₃₂ Cl _{2 N2O}toegevoegd op discrete tijdstippen dierlijke populaties scheiden. Deze beperking kan worden overwonnen door kleurstoffen zoals JC-10 doen verlaten de mitochondriën bij uitschakeling van membraanpotentiaal ^43. Mitochondriën kunnen ook worden geïsoleerd van C. elegans ³⁰ voor verdere biochemische analyse. Dergelijke extractie maakt kwantificering van de mitochondriale membraanpotentiaal door het kwantificeren van het tarief van de lipofiele kationische kleurstof opname met behulp van flowcytometrie of een fluorescerende plaat lezer ^44. Een gemeenschappelijk Europees verminderde mitochondriale membraanpotentiaal, is het ook mogelijk om te bepalen of het verlies van proton gradiënt betekent een verlies van ATP productie gebruik van een gevoelige bioluminometric-luciferase gebaseerde methode ^45.

Het beoordelen van eiwitafbraak bij C. elegans

De worm stam hier gebruikt voor de beoordeling van spiereiwit degradatie was PD55, die een spier specifieke β bevatgalactosidase dat continu gesynthetiseerd tijdens de ontwikkeling tot volwassenheid bereikt welke stabiel in het cytosol blijft voor de volgende 72-96 uur ^19. Zo meten van β-galactosidase niveaus tijdens de ontwikkeling voornamelijk geeft de impact van interventies op de synthese van de myosine promotor, terwijl het verlies van β-galactosidase tijdens de volwassenheid geeft een interventie heeft geleid tot toegenomen cytosole eiwitafbraak ^19. De belangrijkste stap om β-galactosidase activiteit effectieve uitdroging waarborgen. Niet effectief drogen dieren resulteert in een slechte levering van het X-gal-substraat en derhalve slechte kleur in lichaam muur spieren van de dieren. Om een goede uitdroging zorgen voor de afdichting op de exsiccator moet worden gecontroleerd en wordt het monster bij 5-10 min tijden worden gecontroleerd gedurende uitdroging om de voortgang te beoordelen (dat wil zeggen, de 20 ul monster moet zijn binnen 10 min en de resterende 20 min gedroogdis uitgebreide uitdroging verzekeren). De β-galactosidase assay een activiteit assay derhalve een passend is essentieel. Daarnaast verminderde kleuring van volwassenen in een behandeling toestand ten opzichte van de controlegroep niet bewijzen dat bodemaantasting optreedt; veeleer geeft verminderde enzymatische activiteit in reactie op de behandeling. Degradatie bevestigen, moeten meer arbeidsintensieve western blot analyse voltooid tegen β-galactosidase ¹³ en dit maakt kwantificering eiwitafbraak bij kleine populaties getelde wormen. Western Blot band dichtheden kan worden gekwantificeerd met behulp van ImageJ ^46. Een andere beperking van deze werkwijze is dat het gebruik van transgene eiwitten niet informeren over fysiologische doelen van afbraak en voor het antwoorden proteomics en / of gerichte hypothesegedreven Western blots worden gebruikt ^13. Ten slotte moet de synthese van het transgene eiwit toegepast in deze studies sluit in vroege volwassenheid ¹⁹ </sup>, andere methoden moeten worden gebruikt, wanneer die wijzigingen in de eiwitsynthese te onderzoeken in volledig ontwikkelde C. elegans spier; bijvoorbeeld stabiele of radioactieve isotoop methoden.