方法来评估肌肉的亚细胞中<em>温度。线虫</em

这些方法允许肌肉的来自移动macrophysiology的探索，以确定亚细胞缺陷足以造成一个运动缺陷。当结合这些方法让肌肉进行详细分析。的洞察力使肌肉化的假设，涉及到一般的生理学，病理生理学和老化的进一步测试。

测定运动

一个运动缺陷指示正常神经肌肉功能的破坏。这可能是特定于神经或肌肉或它可以是几个共同的组织之间。完成运动检测中最困难的阶段被选择的蠕虫具有代表性的人口和/或治疗，并且还确保实验者时不转移至M9的伤害的动物。具有大的样本大小，以获得运动的代表性和准确的评估是重要的。当测定高度笔etrant的效果，例如作为频繁出现在突变体中，10只动物的样品大小各评估运动10次，足以发现统计学显著差异相对于野生型。然而，运动检测和易于培养线虫的简单性意味着上百蠕虫可以迅速，以确保定量健壮的结果进行评估。当测定显示存在于一个种群中只有一部分的效果，以确定哪些人口的比例似乎受到影响以及缺陷在受影响最严重的动物的严重程度是很重要的。在这样的情况下更大的动物的数量应，以便提供最小的数据为人口受到影响的比例来评价。双方频繁的药物和RNAi治疗会产生严重的运动缺陷人口的一小部分。在某些情况下，增加了治疗和或递送的方法的剂量会增加财务司的比例ected动物和运行的剂量反应曲线可以是在确定药物或RNAi的最佳浓度是有用的。这种运动分析的第二个限制是该蠕虫被操纵，以评估运动。因此，蠕虫都刺激并进行某种程度的渗透胁迫时挑入液体。渗透胁迫的程度可以通过使用的M9或BU相对于水的缓冲器¹⁹来限定。有些限制是通过测量运动习惯在平板上使用市售的跟踪系统³⁴或免费插件为ImageJ的³⁵缓解。测量动物的运动速率可以提供关于整个肌肉健康的重要信息，包括可以在整个生命过程进行测量和非侵袭性这种方法的关键是对肌肉功能的预期寿命长的研究变化的功能。

收缩设备的成像

重要的是要监视蠕虫密切后盖玻片已引入作为压力最终会增加足以引起蠕虫从过度的压力破裂，共后通常10-15分钟verslip加法。附加缓冲器可以与周围的盖玻片边缘一个枪头的帮助下被引入，以避免挤压伤到的蠕虫。指甲涂剂可用于密封所述盖片的边缘和防止蒸发，虽然这可防止动物的检索从盖玻片下，如果需要的话。同样，在该溶液中使用的有机硅珠粒可以帮助减少压力的量上的蠕虫盖玻片的地方。

正如评价的运动缺陷，考虑效果的外显率是很重要的。外显率可以考虑，如果高80-100％的动物显示在NGM板的表型，如果人口显示屏≤20％的部分影响，如果21-79％低。对于高渗透效果，更小的样本大小可以用于产生对肌缺陷显著定量数据。如遇有影响具有低外显率，选择的动物，在应对毒品显示清晰的运动缺陷或RNAi治疗可能是测定在大多数受处理动物肌缺陷很有用。然而，它不一定的情况下的治疗作用，对运动和亚细胞结构的程度是相同的。因此，可以期望以检查存在于人口众多的缺陷的范围内，例如100只动物。这使得缺陷在整个人群中分布情况的了解。它也可能希望检查缺陷的程度，在最严重的影响动物和/或检查的肌节缺损程度和运动缺陷程度之间的相关性。潜在的困难之外，这种方法比评估肌节结构的其它方法更快和更容易。这个速度和方便，然而，保留一个关键性的限制，含有GFP融合蛋白肌节是不完全正常^37，因此，评估破坏肌节的应用附加的劳动密集的方法来确认。这些方法包括使用偏振光^38，鬼笔环肽染色³⁹和间接免疫荧光^40。这些方法中，只有偏振光是相对非侵入性的;其它方法需要固定，因此不能在动物个体的前瞻性研究中使用，而它们只能被用于确认，横截面，从这些研究的结果。

线粒体网络影像

用于线粒体成像实验的蠕虫菌株是CB5600 ⁷其表达定位于线粒体和定位于细胞核GFP的β半乳糖苷酶融合蛋白GFP融合蛋白，无论是在体壁肌肉。与使用PJ727用于成像肌节的，使用该菌株的使线粒体网络结构的活体动物的可视化。因此，该菌株可用于评估所发生的动态变化，例如减少mitochondrial融合和/或增加线粒体裂变^41。另外，作为成像肌节，最大的困难是这种方法是被成像蠕虫还活着动人，使得很难得到良好的聚焦图像。而几种方法，如上面更详细讨论的，可以使用以降低运动，线粒体出现特别敏感的干预，诱导降低的运动。例如，最常用的线粒体呼吸链的麻醉药目标成分，因此必须谨慎在正常线粒体的结构和功能的研究中。同样，大多数麻痹剂必须谨慎在正常线粒体的结构和功能的研究中所用的，因为大多数麻痹剂引起较少信号通过神经肌肉接头和肌肉的功能性去神经是足以诱导线粒体碎片。在本研究的实验中采用的压力来固定动物s但其他已经成功地使用左旋咪唑^42，虽然它是必不可少的图像立即动物。

最后，各种细菌污染的培养，例如枯草芽孢杆菌，可引起线粒体碎片;因此，至关重要的是在分析中包括适当的未处理的对照组。对于高渗透效果，更小的样本大小可以用于产生对线粒体网络缺陷显著定量数据。然而，由于在线粒体网络较小缺陷的发生率，这少数动物很可能是两次所需的肌节的结构的评估的数目。在情况下，作用具有低的渗透率，选择动物响应于药物或RNAi治疗清楚地显示运动缺陷的可能是在测定中大多数受治疗动物的线粒体缺陷是有用的。然而，如上所述，这不是必需的情况，该的治疗效果上的运动和亚细胞结构的程度是相同的。因此，可以期望以检查存在于人口众多的缺陷的范围内，例如150-200的动物，以及破坏在最严重的影响动物的程度和破坏的程度的同程度的存在或不存在运动缺陷。其它菌株的荧光标记的线粒体可用于确认在CB5600获得的结果，然而，使用不同的荧光蛋白可以影响线粒体的基线联网。例如，使用一个TOMM-20的RFP融合蛋白的形象化线粒体似乎导致增加基线线粒体碎片与使用线粒体本地化的GFP ^17。而其它的方法，如免疫荧光显微镜和电子显微镜可用于评估线粒体结构，它们不允许在体内评估线粒体动力学的，因为一个固定步骤是需要ð。其它方法，如使用的线粒体局部染料可用于无固着，因此，也可以代替使用线粒体本地化的GFP的使用。如在下一节中所讨论的，使用这种染料也可以在体内线粒体功能的初步评估。

评估线粒体膜电位的体内线虫

各种染料可用于标记线粒体^28。这些染料提供在活线虫可视线粒体网络结构的另一种方法。许多这些染料也允许的线粒体功能的体内粗的评估，因为它们积累在基于所述线粒体膜电位的线粒体。在这里，我们使用C ₃₂ H ₃₂ Cl ₂中N _{2 O}是通过摄入消化道，经由因为通过溶解在0.5％DMSO中，得到透的角质层一些附加地进入蠕虫。下面进入细胞C _{32 H 32} Cl ₂中的N ₂ O被氧化并通过它结合含有氨基酸（ 例如甲硫氨酸和半胱氨酸）硫线粒体隔离。这些染料-肽复合物的形成是指C _{32 H 32} Cl ₂中N _{2 O}的残留在一次标记²⁸中的线粒体。与使用线粒体染料的一个重要难题是它们将标记所有线粒体中的动物。因此，我们在CB5600，上述用于评估肌肉线粒体网络结构相同的应变进行标记。通过使用红色线粒体染料，蠕虫在肌肉线粒体表达GFP的菌株，和一个三通滤波器，这是相对简单的图像通过发现线粒体即分别为邻肌肉只有线粒体范围内的红色染料和GFP标记线粒体共定位。在执行此共存的方法是最困难的一步是成像，因为染料是光漂白下高强度荧光灯秒之内。这种效果可以通过保持在低功率荧光直到实验者准备的图像，然后相应地调整荧光强度的限制。一旦一个是经历了与使用染料的另一种方法是利用共聚焦显微镜带Z堆叠图像仅在正确的组织线粒体;相比于其它组织中肌线粒体网络是相当明显的。不幸的是，C ₃₂不能H ₃₂ Cl ₂中N _{2 O}的离开线粒体²⁸指的是，与肌节和线粒体成像技术上面讨论的，它不能被用于前瞻性地跟随随时间的线粒体功能的损失，除非C _{32 H 32} CL _{2 N 2 O}在离散的时间点被添加到分开的动物种群。这种限制可以通过使用染料如JC-10，其执行后膜电位⁴³的崩离开线粒体被克服。线粒体也可以从C分离³⁰ 线虫为后续生化分析。这样的提取允许线粒体膜电位的定量通过定量的使用流式细胞术的亲脂性阳离子染料的吸收或荧光板读数器⁴⁴的速率。在确定受损的线粒体膜电位，但也可以，以确定是否质子梯度的损失转化为ATP产生的使用敏感bioluminometric荧光素酶为基础的方法⁴⁵的损失。

评价蛋白降解C.线虫

这里用于评估肌肉蛋白降解的蠕虫菌株是PD55，它包含一个肌肉特异性β半乳糖苷酶，不间断地在整个开发合成，直到成年期达到并保持稳定的细胞质在未来72-96小时^19。因此，在开发过程中β半乳糖苷酶的水平的测量主要是表示干预对合成的肌球蛋白启动子的影响，而β半乳糖苷酶的成年时期的损耗表示干预触发增加胞质蛋白降解^19。在评估β半乳糖苷酶活性的关键步骤是确保有效的干燥。如果不能有效地变干的动物造成规定在动物体壁的肌肉X-gal的衬底和蓝色，因此穷人的穷人。为了确保良好的干燥对干燥机的密封应进行检查和样品应在5-10分钟的间隔进行检查整个干燥评估进展情况（ 即 20微升样品应在10分钟内，剩下的20分钟干为确保全面干燥）。的β半乳糖苷酶测定法，因此活性测定法的适当控制是必不可少的。此外，降低的成年人染色处理条件相对于对照，并不证明降解发生;相反，它表示响应于所述治疗降低酶活性。为了证实降解，更多的劳动力密集型Western blot分析，必须完成对β半乳糖苷酶^13，这使得定量的蛋白质降解在计算虫小种群。免疫印迹条带密度可以使用ImageJ ⁴⁶进行量化。这种方法的另一个局限是，利用转基因蛋白质的不告知以降解的生理指标，并为这样的答案蛋白质组和/或靶向假设驱动的蛋白质印迹必须采用^13。最后，在这些研究中所用的转基因蛋白的合成在成年早期¹⁹关闭</suP>，其他的方法都必须希望检查肌肉蛋白的合成改建全面发展C.时，可以利用线虫的肌肉;例如，稳定或放射性同位素的方法。