Expressão de proteínas fluorescentes em<em> Branchiostoma lanceolatum</em> Por injecção de mRNA em oócitos não fertilizados

Durante o desenvolvimento, uma única célula dá origem a um organismo inteiro num processo altamente complexo que envolve ambos os movimentos e divisões celulares. Para melhor compreender os princípios biológicos subjacentes a dinâmica do comportamento celular, os biólogos do desenvolvimento começaram a usar em técnicas de imagem vivo à base de fluorescência. Compartimentos específicos de células, como as membranas celulares, ou podem ser marcados por meio de tratamentos com corantes fluorescentes, uma abordagem dificultada por uma falta de especificidade e de penetração no tecido ^1, ou pela introdução específica para o embrião de mRNAs exógenos que codificam proteínas fluorescentes ^2. Técnicas diferentes podem ser usadas para a entrega eficiente de substâncias exógenas, tais como ARNm. Estes incluem, mas não se limitam a, microinjecção, electroporação, bombardeamento com micropartículas, lipofecção e transdução de ^3,4. Apesar de todas estas abordagens podem ser utilizadas para introduzir compostos exógeno numadesenvolvimento do embrião, só microinjeção permite a aplicação de quantidades pré-definidas e precisas em cada célula ^3. Técnicas de microinjeção foram descritas para todos os principais sistemas modelo de desenvolvimento ⁴ (por exemplo, moscas de frutas, vermes nematóides, peixe-zebra, sapos, ratos), bem como para alguns modelos alternativos ^4, incluindo aqueles usados ​​para estudos comparativos que visam a compreensão da evolução dos mecanismos de desenvolvimento (por exemplo, anêmonas do mar, vermes anelídeos, ouriços do mar, tunicados de ascídias, o anfioxo cephalochordate).

Cephalochordates que, juntamente com tunicados e vertebrados estabelecer o filo dos cordados, particularmente modelos bem adequado para estudar a evolução de cordados e da diversificação de vertebrados de um ancestral invertebrado ^5-8. A linhagem cephalochordate divergiram muito cedo durante a evolução cordados; e cephalochordates existentes, que são subdivididas em três gêneros (Branchiostoma, Asymmetron e Epigonichthys), se assemelham vertebrados tanto em termos de anatomia geral e arquitetura do genoma ^5-8. Dos cerca de 30 espécies de cephalochordates que foram descritas até agora, cinco estão disponíveis para estudos de embriologia e desenvolvimento: ^6,9 Asymmetron lucayanum (o lancelet Bahama), Branchiostoma floridae (o anfioxo Florida), Branchiostoma lanceolatum (o anfioxo Europeia), Branchiostoma belcheri (o anfioxo chinês) e Branchiostoma japonicum (o anfioxo japonês). Adultos maduros de três destas espécies (B. lanceolatum, B. belcheri e B. japonicum) podem ser induzidas a desovar sob demanda durante a época de reprodução ^10,11. Além disso, pelo menos para B. lanceolatum, desova eficiente pode também ser induzida em água do mar artificial ^12, tornando esta espécie cephalochordate particulares acessível para laborators que não têm acesso à água do mar natural. A combinação, em B. lanceolatum, de um acesso conveniente e confiável para embriões com um método de entrega eficiente, como a microinjeção, até agora a única técnica de entrega desenvolvido em anfioxo (em ambos B. floridae e B. belcheri) ^13-15, permitirá o desenvolvimento de um novela conjunto de técnicas de manipulação, incluindo tracing- linhagem e abordagens baseadas em comportamento de células dinâmica.

Um protocolo para a microinjecção eficiente de ARNm para expressar as proteínas fluorescentes na B. lanceolatum embrião foi, portanto desenvolvido. Além disso, para fornecer um conjunto de ferramentas de base para geração de imagens ao vivo de B. embriões lanceolatum, foram desenvolvidos sistemas de vectores que permitem a associada à membrana e expressão nuclear de proteínas fluorescentes. Para segmentação membrana, maior proteína verde fluorescente (eGFP) foi fundido com a caixa CAAX humano HRAS e localização nuclear de mCherry e eGFP foiobtido por fusão para o peixe-zebra exão histona 2B (H2B) (Figura 1, complementar do ficheiro 1). Além disso, com o objectivo de optimizar a tradução da proteína, as sequências Kozak e codões das construções tenham sido modificados e adaptados para uso em B. lanceolatum. Tomados em conjunto, o método de injecção e vectores de expressão aqui apresentados servem como uma base para a geração de novas abordagens experimentais para cephalochordates, nomeadamente as análises usando o mais recente de fluorescência com base em técnicas de imagiologia in vivo.