L'espressione di proteine ​​fluorescenti in<em> Branchiostoma lanceolatum</em> By mRNA iniezione in ovociti non fecondate

Durante lo sviluppo, una singola cellula dà origine ad un intero organismo in un processo altamente complesso che coinvolge entrambi divisioni e movimenti delle cellule. Per comprendere meglio i principi biologici alla base delle dinamiche del comportamento delle cellule, i biologi dello sviluppo hanno iniziato ad utilizzare de tecniche di imaging in vivo basato sulla fluorescenza. Compartimenti specifici di cellule, come le membrane cellulari, possono sia essere etichettati da trattamenti con coloranti fluorescenti, un approccio ostacolato dalla mancanza di specificità e di penetrazione del tessuto ^1, o dall'introduzione specifica negli embrioni di mRNA esogeni codificanti proteine ​​fluorescenti ^2. Diverse tecniche possono essere utilizzate per l'erogazione efficace dei composti esogeni, quali mRNA. Questi includono, ma non sono limitati a, microiniezione, elettroporazione, bombardamenti con microparticelle, lipofezione e trasduzione ^3,4. Sebbene tutti questi approcci possono essere utilizzati per introdurre composti esogeni in unsviluppo dell'embrione, solo microiniezione consente l'applicazione di quantità predefinite e precisi in ogni cella ^3. Tecniche di microiniezione sono stati descritti per tutti i principali sistemi di modelli di sviluppo ⁴ (ad esempio, i moscerini della frutta, vermi nematodi, zebrafish, rane, topi), oltre che per alcuni modelli alternativi ^{di 4,} compresi quelli utilizzati per gli studi comparativi volti a comprendere l'evoluzione dei meccanismi di sviluppo (ad esempio, anemoni di mare, vermi anellidi, ricci di mare, tunicati ascidie, l'anfiosso Cephalochordata).

Cephalochordates, che insieme con i tunicati e vertebrati stabiliscono il phylum cordati, particolarmente modelli adatto per studiare l'evoluzione dei Cordati e la diversificazione dei vertebrati da un antenato invertebrato ^5-8. Il lignaggio Cephalochordata discostato molto presto durante l'evoluzione dei cordati; e cephalochordates esistenti, che si suddividono in tre generi (Branchiostoma, Asymmetron e Epigonichthys), assomigliano vertebrati sia in termini di anatomia generale e l'architettura del genoma ^5-8. Delle circa 30 specie di cephalochordates che sono stati descritti finora, cinque sono disponibili per gli studi embriologici e sviluppo ^6,9: Asymmetron lucayanum (il lancelet Bahama), Branchiostoma floridae (l'anfiosso Florida), Branchiostoma lanceolatum (l'anfiosso europeo), Branchiostoma belcheri (l'anfiosso cinese) e Branchiostoma japonicum (l'anfiosso giapponese). Adulti maturi di tre di queste specie (B. lanceolatum, B. belcheri e B. japonicum) possono essere indotti a deporre le uova su richiesta durante la stagione riproduttiva ^10,11. Inoltre, almeno per B. lanceolatum, la deposizione delle uova efficiente può anche essere indotta in acqua di mare artificiale ^12, rendendo in tal modo questa particolare specie Cephalochordata accessibile per laboratorIES che non hanno accesso ad acqua di mare naturale. La combinazione, in B. lanceolatum, di un accesso comodo e affidabile per gli embrioni con un metodo di consegna efficiente, come ad esempio la microiniezione, finora l'unica tecnica di consegna sviluppata in anfiosso (sia in B. floridae e B. belcheri) ^13-15, consentirà lo sviluppo di un romanzo suite di tecniche manipolative, tra cui lignaggio tracing- e approcci basati sul comportamento di cellule dinamica.

Un protocollo per la microiniezione di mRNA efficace per esprimere le proteine ​​fluorescenti in B. lanceolatum embrione è stato sviluppato di conseguenza. Inoltre, per fornire un kit di strumenti di base per l'imaging dal vivo di B. embrioni lanceolatum, sistemi di vettori sono stati sviluppati che permettono associata alla membrana ed espressione nucleare di proteine ​​fluorescenti. Per membrane targeting, maggiore proteina fluorescente verde (eGFP) è stato fuso con la casella CAAX umana HRAS e localizzazione nucleare di mCherry e eGFP eraottenute per fusione alla esone zebrafish istone 2B (H2B) (Figura 1, File supplementare 1). Inoltre, con lo scopo di ottimizzare la traduzione della proteina, le sequenze Kozak e codoni dei costrutti sono stati modificati e adattati all'uso in B. lanceolatum. Nel loro insieme, il metodo di iniezione e di espressione vettori qui presentati serviranno da base per la generazione di nuovi approcci sperimentali per cephalochordates, in particolare analisi utilizzando la più recente a fluorescenza a base di tecniche di imaging in vivo.